大腸菌で発現させたThermus aquaticus由来耐熱性ホスホリラーゼの構造と諸性質 Structure and Properties of Thermus aquaticus α-Glucan Phosphorylase Expressed in Escherichia coli

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抄録

 Thermus aquaticus由来耐熱性ホスホリラーゼの部分アミノ酸配列を利用して,本酵素遺伝子を単離し,塩基配列を決定した.本遺伝子のORF部分(2460塩基対)をtacプロモーター制御下に組み込んだ発現ベクターを保持する大腸菌は,耐熱性ホスホリラーゼ活性を示し,このことから本遺伝子が,ホスホリラーゼをコードしていることを証明した.大腸菌で発現させた本酵素をSDS-PAGEで単一バンドを示すまで綴し,諸性質を調べた.本酵素のグルカン合成反応における最小のプライマーはマルトトリオース,分解反応における最小の基質はマルトテトラオースであった.これらは通常のホスホリラーゼに比べ,それぞれグルコース1単位ずつ短く,新たな基質特異性を有する酵素であった.本酵素はその構造においても,通常のホスホリラーゼと異なり,新たなホスホリラーゼグループに属する酵素であると考えられた.

The α-glucan phosphorylase gene from Thermus aquaticus was isolated using partial amino acid sequences of purified enzyme. The identity of the gene was confirmed by expression in Es cherichia coli resulting in thermostable glucan phosphorylase activity. The open reading frame of this gene consisted of 2460 by and encoded a polypeptide of 819 amino acids. The deduced amino acid sequence exhibits high identity (32-43%) to 7 putative and 2 characterized glucan phosphorylases, but showed weak similarity to other well characterized glucan phosphorylases from various sources. Due to its high expression level and thermal stability, the recombinant enzyme was easily purified from E. coli cell extracts, and employed to characterize its activity. The smallest primer molecule for a synthetic reaction was maltotriose and the smallest effective substrate for a degrada tion reaction was maltotetraose. These results suggest that T. aquaticus glucan phosphorylase, and at least 9 other enzymes, form a new group of glucan phosphorylases whose structure and substrate specificity differ from the traditional glucan phosphorylases. The purified enzyme was also em ployed to investigate the effect of temperature and pH on the activities in both directions. The ac tivity exhibited a pH optimum of 8.0 for phosphorolytic reaction but 7.0 for synthesis reaction. The optimum temperature for phosphorolytic reaction was 80-85°C, while the one for synthesis reaction was 50°C.

収録刊行物

  • 応用糖質科学 : oyo toshitsu kagaku = Journal of applied glycoscience

    応用糖質科学 : oyo toshitsu kagaku = Journal of applied glycoscience 48(1), 71-78, 2001-01-01

    日本応用糖質科学会

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各種コード

  • NII論文ID(NAID)
    10008252436
  • NII書誌ID(NCID)
    AN10453916
  • 本文言語コード
    ENG
  • 資料種別
    ART
  • ISSN
    13403494
  • NDL 記事登録ID
    5648295
  • NDL 雑誌分類
    ZP24(科学技術--化学・化学工業--糖・澱粉)
  • NDL 請求記号
    Z17-15
  • データ提供元
    CJP書誌  NDL  IR  J-STAGE 
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