新規環状五糖イソサイクロマルトペンタオースを生成する新規グルカノトランスフェラーゼ A Novel Glucanotransferase that Produces a Cyclomaltopentaose Cyclized by an α-1,6-Linkage

この論文にアクセスする

この論文をさがす

著者

    • 渡邊 光 WATANABE Hikaru
    • 株式会社林原生物化学研究所研究センター糖質研究部門 Glycoscience Institute, Research Center, Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.
    • 西本 友之 NISHIMOTO Tomoyuki
    • 株式会社林原生物化学研究所研究センター糖質研究部門 Glycoscience Institute, Research Center, Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.
    • 茶圓 博人 [他] CHAEN Hiroto
    • 株式会社林原生物化学研究所研究センター糖質研究部門 Glycoscience Institute, Research Center, Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.
    • 福田 恵温 FUKUDA Shigeharu
    • 株式会社林原生物化学研究所研究センター糖質研究部門 Glycoscience Institute, Research Center, Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.

抄録

澱粉から酵素的に生成するオリゴ糖を広く検索したところ,土壌由来細菌<i>Bacillus circulans</i> AM7株の培養上清中に未知糖質を生成する活性を見出した.未知糖質を単離し構造を決定したところ,マルトペンタオースがα-1,6結合で環状化した新規環状五糖,<i>cyclo</i>-{→6)-α-<small>D</small>-Glc<i>p</i>-(1→4)-α-<small>D</small>-Glc<i>p</i>-(1→4)-α-<small>D</small>-Glc<i>p</i>-(1→4)-α-<small>D</small>-Glc<i>p</i>-(1→4)-α-<small>D</small>-Glc<i>p</i>-(1→},であった.われわれは本糖質をイソサイクロマルトペンタオース (ICG5) と命名した.ICG5生成に関与する酵素を精製し,諸性質を調べた.本酵素は分子量106.3 kDa (SDS-PAGE),最適pH 4.5-8.0,最適温度50-55°C,pH安定性4.5-9.0,温度安定性35°Cまで (1 m<small>M</small> Ca<sup>2+</sup>存在下で40°Cまで) で,重合度3以上のマルトオリゴ糖や澱粉に作用しICG5を生成した.本酵素のマルトヘプタオースへの作用を経時的に観察したところ,反応初期からICG5の生成 (環状化反応) とともにマルトオリゴ糖単位の再配列反応がみられた.これらの結果から本酵素は新規なグルカノトランスフェラーゼであることがわかり,イソサイクロマルトオリゴ糖グルカノトランスフェラーゼ (IGTase) と命名した.IGTaseの1次構造を明らかにするため,本酵素遺伝子 (<i>igtY</i>) をクローニングし塩基配列を決定した.本酵素遺伝子は2985 bpからなり,シグナルペプチド35残基を含む995アミノ酸からなるタンパク質 (分子量105.9 kDa) をコードしていることがわかった.本酵素のアミノ酸配列中にはα-アミラーゼやCGTaseなどの間で保存されている4カ所の共通領域が存在し,本酵素は"α-アミラーゼファミリー"に属することが示唆された.またC末端領域にはcarbohydrate-binding module family 25 (CBM25) に属する澱粉結合ドメインが2カ所存在した.また,本酵素遺伝子の直後に糖質関連酵素をコードすると考えられる遺伝子 (<i>igtZ</i>) が存在した.<i>IgtZ</i>をクローニングし塩基配列を決定したところ,本遺伝子は3870 bpからなり,1290アミノ酸からなるタンパク質 (IgtZ;分子量138.8 kDa) をコードしていることがわかった.IgtZの触媒部分と相同性がみられるタンパク質は報告されていなかったが,C末端領域にはIGTaseと同様にCBM 25に属する澱粉結合ドメインが2カ所存在した.大腸菌を用いて発現させた組換えIgtZを精製し,その諸性質を調べたところ,α-アミラーゼ活性を有していることがわかった.IGTaseと組換えIgtZを可溶性澱粉または生澱粉に作用させ,ICG5の生成率を検討した.可溶性澱粉に両酵素が作用した場合はIGTase単独に比べて生成率は低下したが,生澱粉に両酵素が作用した場合はIGTase単独に比べて2倍の生成率を示した.このことから,両酵素は生澱粉から効率よくICG5を生成するために宿主菌株に備わった機構であることが示唆された.

A novel glucanotransferase, involved in the synthesis of a cyclomaltopentaose cyclized by an α-1,6-linkage [ICG5; <i>cyclo</i>-{→6)-α-<small>D</small>-Glc<i>p</i>-(1→4)-α-<small>D</small>-Glc<i>p</i>-(1→4)-α-<small>D</small>-Glc<i>p</i>-(1→4)-α-<small>D</small>-Glc<i>p</i>-(1→4)-α-<small>D</small>-Glc<i>p</i>-(1→}], from starch, was purified to homogeneity from the culture supernatant of <i>Bacillus circulans</i> AM7. The p<i>I</i> was estimated to be 7.5. The molecular mass of the enzyme was estimated to be 184 kDa by gel filtration and 106 kDa by SDS-PAGE. These results suggest that the enzyme forms a dimer structure. It was most active at pH 4.5 to 8.0 at 50°C, and stable from pH 4.5 to 9.0 at up to 35°C. The addition of 1 m<small>M</small> Ca<sup>2+</sup> enhanced the thermal stability of the enzyme up to 40°C. It acted on maltooligosaccharides that have degrees of polymerization (DP) of 3 or more, amylose, and soluble starch, to produce ICG5 by an intramolecular α-1,6-glycosyl transfer reaction. It also catalyzed the transfer of part of a linear oligosaccharide to another oligosaccharide by an intermolecular α-1,4-glycosyl transfer reaction. Thus the ICG5-forming enzyme was found to be a novel glucanotransferase. We propose isocyclomaltooligosaccharide glucanotransferase (IGTase) as the trivial name of this enzyme. The gene for IGTase was cloned from the genome of <i>B. circulans</i> AM7. The IGTase gene, designated <i>igtY</i>, consisted of 2985 bp encoding a signal peptide of 35 amino acids and a mature protein of 960 amino acids with a calculated molecular mass of 102,071 Da. The four conserved regions common in the α-amylase family enzymes were found in this enzyme, indicating that this enzyme should be assigned to this family. The DNA sequence of 8325-bp analyzed in this study contained two open reading frames (ORFs) downstream of <i>igtY</i>. The first ORF, designated <i>igtZ</i>, formed a gene cluster, <i>igtYZ</i>. The amino-acid sequence deduced from <i>igtZ</i> exhibited no similarity to any proteins with known or unknown functions. <i>IgtZ</i> was expressed in <i>Escherichia coli</i>, and the enzyme (IgtZ) was purified. The enzyme acted on maltooligosaccharides that have a DP of 4 or more, amylose, and soluble starch to produce glucose and maltooligosaccharides up to DP5 by a hydrolysis reaction. The enzyme, which has a novel amino-acid sequence, should be assigned to α-amylase. It is notable that both IGTase and IgtZ have a tandem sequence similar to a carbohydrate-binding module belonging to family 25. These two enzymes jointly acted on raw starch, and efficiently generated ICG5.

収録刊行物

  • Journal of applied glycoscience  

    Journal of applied glycoscience 54(2), 109-118, 2007-04-20 

    The Japanese Society of Applied Glycoscience

参考文献:  26件

参考文献を見るにはログインが必要です。ユーザIDをお持ちでない方は新規登録してください。

各種コード

  • NII論文ID(NAID)
    10018617552
  • NII書誌ID(NCID)
    AA11809133
  • 本文言語コード
    ENG
  • 資料種別
    REV
  • ISSN
    13447882
  • NDL 記事登録ID
    8827971
  • NDL 雑誌分類
    ZP24(科学技術--化学・化学工業--糖・澱粉)
  • NDL 請求記号
    Z17-15
  • データ提供元
    CJP書誌  NDL  J-STAGE 
ページトップへ