Amycolatopsis orientalis 由来エキソ-β-グルコサミニダーゼの構造と機能 Structure and Function of Exo-β-glucosaminidase from Amycolatopsis orientalis

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抄録

<i>Amycolatopsis orientalis</i>由来エキソ-β-グルコサミニダーゼ(GlcNase)の遺伝子のクローニングを行い,その配列を調べた.その結果,本酵素は1032個のアミノ酸からなり,その配列から推定される分子量は,110,557と算出された.アミノ酸配列に基づいて,本酵素はfamily GH-2に属し,その中でその他のGlcNase遺伝子とともにGlcNaseサブクラスを形成していることがわかった.モノアセチル化キトテトラオース[(GlcN)<sub>3</sub>-GlcNAc]を本酵素で加水分解すると,非還元末端からGlcN残基が放出され,さらに糖転移反応生成物も得られることがわかった.-1サイトではGlcNに対して高い特異性をもつが,+1サイトではそのような特異性はみられなかった.実験的に得られたキトテトラオース[(GlcN)<sub>4</sub>]に対する反応の経時変化に基づいて,各サブサイトの親和性(結合自由エネルギー変化)を推定したところ,-2,-1,+1,+2,+3,+4のそれぞれに対して,+7,0,-2.9,-1.8,-0.9,-1.0,-0.5kcal/molという値を見積もることができた.本酵素を<i>Streptomyces</i> sp. N174由来エンドキトサナーゼと混合させて,高分子キトサンを基質として反応させたところ,明確な相乗効果を確認することができた.family GH-2に属するいくつかの酵素とのシーケンスアラインメントおよび部位特異的変異導入によって,触媒残基はAsp469とGlu541であることが明らかになった.

We cloned and sequenced the gene encoding exo-β-glucosaminidase (GlcNase) from <i>Amycolatopsis orientalis</i>, and found that the gene has an open reading frame of 1032 residues with a calculated molecular mass of 110,557. The GlcNase has been classified as a member of family GH-2. Sequence alignments identified a group of GlcNase-related protein sequences forming a distinct subclass of family GH-2. When mono-<i>N</i>-acetylated chitotetraose [(GlcN)<sub>3</sub>-GlcNAc] was hydrolyzed by the enzyme, the GlcN unit was produced from the nonreducing end together with the transglycosylation products. <sup>1</sup>H-NMR spectroscopy revealed that the enzyme is a retaining glycoside hydrolase. The rate of hydrolysis of the disaccharide, GlcN-GlcNAc, was somewhat lower than that of (GlcN)<sub>2</sub>, suggesting that the <i>N</i>-acetyl group of the sugar residue located at (+1) site partly interferes with the catalytic reaction. Based on the time-course of the enzymatic hydrolysis of the completely deacetylated chitotetraose [(GlcN)<sub>4</sub>], we obtained the values of binding free energy changes of +7.0, -2.9, -1.8, -0.9, -1.0 and -0.5 kcal/mol corresponding, respectively, to subsites (-2) (-1) (+1) (+2) (+3) (+4). Synergism resulting from mixing the <i>A</i>. <i>orientalis</i> GlcNase with <i>Streptomyces</i> sp. N174 endochitosanase was also observed when chitosan polysaccharide was used as the substrate. To identify the catalytic residue, mutations were introduced into the putative catalytic residues resulting in five mutated enzymes (D469A, D469E, E541D, E541Q and S468N/D469E) which were successfully produced. The four single mutants were devoid of enzymatic activity, indicating that Asp469 and Glu541 are essential for catalysis as predicted from sequence alignment of enzymes belonging to GH-2 family.

収録刊行物

  • Journal of applied glycoscience  

    Journal of applied glycoscience 54(2), 133-138, 2007-04-20 

    The Japanese Society of Applied Glycoscience

参考文献:  32件

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各種コード

  • NII論文ID(NAID)
    10018617656
  • NII書誌ID(NCID)
    AA11809133
  • 本文言語コード
    ENG
  • 資料種別
    REV
  • ISSN
    13447882
  • NDL 記事登録ID
    8828061
  • NDL 雑誌分類
    ZP24(科学技術--化学・化学工業--糖・澱粉)
  • NDL 請求記号
    Z17-15
  • データ提供元
    CJP書誌  NDL  J-STAGE 
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