Phosphoinositide (PI) 3-kinase p85 サブユニット上の PI3-kinase 活性結合部位の同定

細胞をインスリンで刺激すると,インスリン依存性に,抗フォスフォチロシン抗体でPhosphoinositide(PI) 3-kinase活性が免疫沈降されることが見いだされ,近年これは,インスリン依存性にリン酸化を受けたInsulin Receptor Substrate-1 (IRS-1) とPI3-kinaseがcomplexを形成するためであることが明らかとなった。PI3-kinaseはp85とp110の2つのサブユニットからなり, p85は2つのSH2ドメインを有し, p110に存在するPI3-kinase活性をIRS-1に結合させるadaptorとしての役割を担っていると考えられている。今回,インスリン作用におけるPI3-kinaseの役割を検討する上で有用と恩われるp85上のPI3-kinase活性結合部位の同定を試みた。まずin vitroにおいてGST.fusion蛋白として発現したp85とPI3-kinase活性との結合を同定する実験系を確立し,続いて,種々のmutant p85を作製し,この系において検討したところ,p85上のinter SH2ドメインN末側が, PI3-kinase活性との結合に重要であることが推定された。更にtransient発現系を用い,in vivoにおいても同部位がp85上のPI3-kinase活性結合部位であることを確認した。

Insulin treatment of cells has been found to increase PI3-kinase activity in immunoprecipitates made using antibody to phosphotyrosine. Recently, it has been demonstrated that this is due to the insulin-drived complex formation between tyrosine-phosphorylated Insulin Receptor Substrate-1 (IRS-1) and PI3-kinase. PI3-kinase consists of regulatory p85 sub unit and catalytic p110 subunit. p85subunit has two SH2 domains and is thought to act as a adaptor to link PI3-kinase a~tivity existing on pHD subunit to IRS-1. In the present study, to elucidate the interaction between p85 and pHD sub units of PI3-kinase, we examined the binding site on p85 subunit for PI3-kinase activity. First, we established the in vitro assay system to detect the association of PI3-kinase activity with p85 sub units expressed as GST fusion proteins. Using a panel of p85 mutants, we found that 35 amino acids at the N terminal region of inter SH2 domain is the possible binding site on p85 sub unit for PI3-kinase activity. Transient expression of mutant p85, which lacks the 35 amino acids, in mouse L cells revealed that the mutant failed to associate PI3-kinase activity, indicating that this region is involved in the binding of p85 to PI3-kinase activity in vivo.