精製ミネラルパラフィンオイルと無血清培地へのヘモグロビン添加による微小滴胚培養システムの改善 Renovation of a Drop Embryo Cultures System by Using Refined Mineral oil and the Effect of Glucose and/or Hemoglobin Added to a Serum-free Medium

胚培養システムの改善はin vitroにおける着床前発育の改良に貢献でき,胚工学の研究を推進できる。今回の研究では精製ミネラルパラフィンオイルと無血清培地へのヘモグロビンとグルコースの添加が微小滴培養システムにおける胚の発育を改善できるか評価するために行われた。1細胞期あるいは2細胞期のICRマウス胚を実験に用い,胚を着床前発育に及ぼす処置効果を判定するためにCZB無血清培地で培養した。実験1では,1細胞期胚を,1)無洗滌,2)DWで洗滌,3)培養液で洗滌されたミネラルパラフィンオイルで覆った微小滴培養液で培養した。使用したオイルはSigma-Aldrich社およびBDH社から購入し,それぞれ実験に供した。Sigma社のオイルの方がBHD社のオイルに比べて胚の発育は有意(p<0.0001)に良好であった。また,培養液で洗條したSigma社のオイルでは他の処理に比べて胚盤胞への発育が良好であった(37%と0%)。実験2と3では,1から2細胞期の胚を培養液で洗濠したSigma社製オイルで覆われたCZB培地の微小滴内で培養し,それにヘモグロビン(0.001mg/m1)と5.6mMグルコースを1細胞期胚と4細胞期胚に添加した。胚の発育ステージとは無関係に胚盤胞への発育はヘモグロビンの添加によって有意に改善された(1細胞期胚では54から48% vs 42から31%,2細胞期胚では83から78% vs 65から68%)。この効果はグルコースの添加とは無関係であり,グルコース添加後の効果は見い出されなかった。結論として,ミネラルパラフィンオイルの選択と精製およびCZB無血清培地へのヘモグロビンの添加は微小滴培養の効果を促進する上で重要である。

This study was conducted to evaluate whether refining mineral oil and the addition of hemoglobin and/or glucose to a serum-free medium could improve in vitro-development of embryos cultured in a chemicallysemi-defined microdroplet culture system. Block strain, outbred (ICR) mouse 1- or 2-cell embryos were cultured in 5 μl droplets of Chatot, Ziomek and Bavister medium overlaid with mineral oil of different types, and preimplantation development to the blastocyst stage was subsequently monitored. In the experiment 1, either Sigma (M-841 0) or BDH (GPR^<TM>) mineral oil with or without washing was used for embryo culture and, distilled water (DW) or culture medium was used as a washing agent. As results, better (P<0.000l) development of 1-cell embryos was found in the Sigma than in the BDH; more blastocysts developed in Sigma oil washed with culture medium than in the others (37% vs. 0%). Subsequently, 1- (experiment 2) or 2-cell (experiment 3) embryos were cultured in the droplets overlaid with medium-washed Sigma oil, to which 0.001 mg/ml hemoglobin and/or 5.6 mM glucose were supplemented at the 1-cell and the 4-cell stages, respectively. Regardless of embryo stages, blastocyst formation was significantly improved by the addition of hemoglobin (54 to 48% vs. 42 to 31% in 1-cell and 83 to 78% vs. 65 to 68% in 2-cell embryos) and this effect was independent of glucose addition. In conclusion, the selection and washing of mineral oil, and the addition of hemoglobin is beneficial for improving the efficacy of a drop embryo culture system using a serum-free medium.