骨外性粘液型軟骨肉腫にみられるEWS-CHN融合変異遺伝子の解析  [in Japanese] Analysis of the EWS-CHN Fusion Gene in Extraskeletal Myxoid Chondrosarcoma  [in Japanese]

骨外性粘液型軟骨肉腫(EMC)は軟部組織に発生する希な腫瘍である。近年,多くのEMC症例にEWS-CHN,TAF2N-CHN,TCF12-CHNという特異的な融合遺伝子が報告され,診断学に応用されているが,その役割については不明な部分が多い。今回9症例のEMCを分子生物学的に検索し,融合遺伝子の有無およびその機能を解析した。その結果,6例にEWS-CHN,3例にTAF2N-CHNの遺伝子融合が認められた。EWS-CHN融合遺伝子については,従来報告されている融合部位とは異なる新しい融合部位が複数みられた。融合遺伝子の役割を調べるため,新たに見出されたEWS-CHN融合遺伝子を組み込んだ発現ベクター(pEC1.5)とEWS遺伝子全長を含む発現ベクター(pEWS)を構築し,種々の量で細胞に導入して蛋白解析を行った結果,導入したpEC1.5のDNA量依存性に複数の蛋白において細胞内蛋白量の変動が認められた。ウエスタンブロットの結果,pEC1.5は80kD,pEWSは85kDに特異的蛋白の発現が確認された。ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果,pEC1.5導入後の活性はコントロールに比べ,わずかに上昇する傾向がみられた。EMC発生とp53経路の関連性の有無を調べるため,p21プロモーターの下流にルシフェラーゼを組み込んだプラスミドを導入した細胞でルシフェラーゼ活性を測定した結果,pEC1.5導入細胞ではコントロールに比べて活性が低下しており,EWS-CHN融合遺伝子のp53経路への関与が推察された。これらの結果より,EWS-CHN融合遺伝子産物は転写・翻訳レベルで影響を及ぼし,ある蛋白の合成を低下,または増加させることが示唆され,EMC発症に至るメカニズムの一端を担っていると考えられた。

Extraskeletal myxoid chondrosarcoma (EMC) is known as a rare malignant soft tissue tumor. Recently, chromosomal rearrangements by the translocation, t(9;15), t(9;17), and t(9;22) have been identified in the many cases of EMC. These rearrangements result in gene fusions, I.e. TCF12-CHN, TAF2N-CHN and EWS-CHN. However, the function of fusion proteins is unknown. We analyzed 9 cases of EMC and found fusion gene of EWS-CHN and TAF2N-CHN by molecular analysis. EWS-CHN fusion transcripts were detected in 6 cases and TAF2N-CHN transcripts in 3 cases. We identified novel EWS-CHN fusion junctions. To examine the function of EWS-CHN fusion protein, we constructed two kinds of expression vectors of EWS-CHN fusion gene (pEC 1.5) and EWS gene (pEWS). Proteins in COS cells transfected with pEC 1.5 or pEWS were analyzed by SDS-gel electrophoresis and blotted to PVDF membrane. The results indicated that amounts of several proteins increased or decreased in the cell transfected with pEC 1.5. In the case of pEWS transfection, such change of cellular proteins was not so big. We detected 80kD and 85kD proteins in the COS cells transfected with pEC 1.5 and pEWS, respectively. To investigate the biological significance of fusion protein, we performed the luciferase reporter assay. The result in the experiment using luciferase mRNA JEL3' showed that luciferase activity in the cells transfected with pEC 1.5 tended to be slightly elevated than that of control cells. On the other hand, luciferase activity in the cells transfected with pEWS did not differ from the control. To examine the effect of fusion protein on the transcription, we performed luciferase reporter assay using the vector (pGL-p21) containing p21 promoter. The results indicated that luciferase activity in COS cells transfected with pEC1.5 was lower than that of control. However, the activity in the pEWS-transfected cells was the same as in the control. These results suggest that EWS-CHN fusion protein influences the expression level of some proteins, may be associated with p53 pathway and may exert oncogenic potential in EMC.