ブタ永久歯エナメル叢中に含まれるタンパク質について Proteins in Enamel Tuft of Porcine Mature Teeth

本研究では,ブタ永久歯エナメル質のエナメル叢のタンパク成分を分析し,エナメル叢の形成過程を調べることを目的とした.エナメル質を0.5mol/l酢酸溶液で脱灰して,象牙質表面に残存する構造物のエナメル叢を実体顕微鏡下でピンセットを用いて採取した.このエナメル叢には多量のミネラルが残存するため,酢酸溶液を加えさらに脱灰し,可溶性画分と不溶性画分に分けて凍結乾燥し,試料とした.試料は,SDS電気泳動,質量分析,Western blottingで分析した.電気泳動後の銀染色像から,エナメル質の酢酸脱灰後のエナメル叢には,多種類のタンパク成分が存在し,質量分析とWestern blottingの結果から,その中に多量に,血液成分であるアルブミン,α-2-HS-グリコプロテイン,ヘモグロビンが,また少量であるが,エナメルタンパクであるアメロゲニン,エナメリン,シースプロテインが存在していることがわかった.血液成分については,多数の分解産物が含まれていたので,分解にかかる時間経過を考慮すると,これらが調製時の血液の混入によるのではなく,エナメル叢に固有に含まれているものと考えられた.成熟エナメル質のエナメル叢中のアルブミンの由来を検討するために,永久歯切歯の歯胚中の各種幼若エナメル質を調製し,それらについて,アルブミンをWestern blottingで調べた.その結果,エナメル象牙境のエナメル質側に存在する高石灰化エナメル質のみで反応を示した.象牙質には検出されなかった.高石灰化エナメル質は,位置的にエナメル質形成の分化期に相当する.このため,エナメル質形成の分化期中に混入した血液自体が,エナメル質中の酵素では分解されにくいことから残留し,エナメル質の結晶成長とともにアルブミンが濃縮され,多量にエナメル叢中に存在するようになったと考えられる.

The purpose of this study was to determine the protein components of enamel tuft of porcine mature enamel and to investigate its formation processes. During demineralization of mature enamel with 0.5mol/l acetic acid, the insoluble structure, which includes the enamel tuft, along with the surface of the dentin was collected with tweezers. Since the collected enamel tuft still contained minerals, it was further demineralized with acetic acid and divided into soluble and insoluble samples. The freeze-dried samples were analyzed by SDS electrophoresis, mass spectrometry and Western blotting. From silver staining following electrophoresis, many protein bands in the enamel tuft were observed after demineralization with acetic acid. Mass spectrometry and Western blotting identified these bands to be mainly blood proteins (albumin, α-2-HS-glycoprotein and hemoglobin) and a small amount of enamel proteins (amelogenin, enamelin and sheath protein); degraded fragments of the blood proteins were also found. Therefore, the blood proteins reside in the enamel tuft itself, and do not contaminate the sample during preparation. The origin of albumin found in the enamel tuft was further investigated by examining several immature enamels using Western blotting. Albumin was only found in the highly mineralized enamel layer at the enamel-dentin junction, and not at the secretory, transition and maturation stages of the enamel and dentin. These results suggest that blood invades the enamel at the initiation stage, which corresponds to the highly mineralized enamel layer, and that the blood proteins cannot be degraded by enamel proteinases, allowing them to condense in the enamel tuft during crystallization.