CTC-SYBR Green I二重蛍光染色法による土壌中の呼吸活性陽性菌の定量 Enumeration of actively respiring bacteria in soil using the CTC-SYBR green I double-staining method

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著者

    • 龍田 典子 Ryuda Noriko
    • 佐賀大学農学部:鹿児島大学大学院連合農学研究科 Division of Soil Environment, Faculty of Agriculture, Saga University:The United Graduate School of Agricultural Sciences, Kagoshima University

抄録

環境中の呼吸活性を持つ細菌を定量する方法に,5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)法がある。この方法では,呼吸鎖と共役して還元され細胞内に沈着したCTC-ホルマザン粒子を蛍光顕微鏡下で検出する。本研究では,全細菌を検出するSYBR Green I (SG)をCTCと併用したCTC-SG二重蛍光染色法(CTC-SG法)の土壌試料への適用を検討した。E. coliなど5種の新鮮培養細胞をCTC-SG法に供試すると,良好な染色性(全細胞の62〜95%)が認められた。このとき,CTC-ホルマザン粒子が1細胞上に複数個存在する場合や細胞外にも存在する場合が認められ,従来のCTC単染色法ではこれらも含めて計数されるため,1.2〜1.6倍過大評価となった。水田および畑土壌中のCTC-SG法による呼吸活性陽性細菌数は全菌数の10〜12%に相当し,培養可能な細菌数の1.5〜5.2倍であった。以上の結果から,CTC-SG法は,CTC単染色法の欠点を改善し,土壌中の呼吸活性を有する生きた細菌の定量に適用できることが示唆された。

The tetrazolium salt 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC) has been employed for the detection and enumeration of respiratory-active bacteria in environmental samples. In this method, CTC was reduced by a respiratory chain to form CTC-formazan crystals, which were deposited intracellularly and were enumerated under an epifluorescence microscope. We evaluated a CTC-SYBR Green I double-staining (CTC-SG) method, by which both CTC-formazan particles and whole cells could be observed by CTC and SG, respectively. Pure culture studies of several Gram-positive and -negative bacteria revealed that one or more CTC-formazan crystals were observed in a single bacterial cell and extracellularly. Consequently, the conventional CTC method gave counts 1.2-1.6 times higher than the CTC-SG method, suggesting overestimation by the CTC method. A starved culture of E coil showed the presence of viable but nonculturable cells, as detected by the CTC-SG method after two weeks of incubation. The counts of metabolically active bacteria in upland and paddy soils by the CTC-SG method were 4.5×10^8-1.4×10^9 cells g^<-1> dry soil, which were as much as 10-12% of the total bacterial count and 1.5-5.2 times higher than the plate counts. These results suggest that the CTC-SG method gives more accurate counts of respiratory-active bacteria in soil samples than the conventional CTC method.

収録刊行物

  • 土と微生物

    土と微生物 64(1), 18-24, 2010

    土壌微生物研究会

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各種コード

  • NII論文ID(NAID)
    110009468711
  • NII書誌ID(NCID)
    AN00352796
  • 本文言語コード
    JPN
  • 資料種別
    Journal Article
  • ISSN
    09122184
  • NDL 記事登録ID
    10673236
  • NDL 雑誌分類
    ZR5(科学技術--生物学--菌類・微生物)
  • NDL 請求記号
    Z18-1873
  • データ提供元
    CJP引用  NDL  NII-ELS  IR  J-STAGE 
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