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GH54α-L-アラビノフラノシダーゼの構造決定と機能解析

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著者

    • 宮永, 顕正 ミヤナガ, アキマサ

書誌事項

タイトル

GH54α-L-アラビノフラノシダーゼの構造決定と機能解析

著者名

宮永, 顕正

著者別名

ミヤナガ, アキマサ

学位授与大学

東京大学

取得学位

博士 (農学)

学位授与番号

甲第21268号

学位授与年月日

2006-03-23

注記・抄録

博士論文

序論植物細胞壁は、セルロース、ヘミセルロース、リグニンという主に3つの成分からなっている。そのうち、ヘミセルロースには様々な種類が存在し、構成する糖の種類が多く、結合様式も複雑なため、それを分解するヘミセルラーゼも多様に存在する。糖質加水分解酵素 (GH) はグリコシド結合を切断する反応を行う。GHはアミノ酸配列に基づいて分類されたファミリーで構成されており、現在約100のファミリーが登録されている。ヘミセルラーゼは、このGHに属しているものが多く、しばしば触媒ドメインとは別に糖質結合ドメイン (CBM) を有している。CBMは不溶性糖基質に結合して触媒ドメインの反応効率を上昇させる役割を持っており、アミノ酸配列から現在40以上のファミリーに分類されている。ヘミセルロースの一種であるアラビノキシランは、図1に示すようにキシロースで構成される主鎖にアラビノースなどの側鎖が結合しているという構造をとる。アラビノフラノシダーゼは、このアラビノース側鎖を分解する酵素であり、焼酎の発酵において穀物の分解や香り成分の生成を助ける役割をすることから、醸造産業において重要な酵素の一つである。焼酎白麹菌Aspergillus kawachiiは、GH51に属しているAkAbf51とGH54に属しているAkAbf54の2種類のアラビノフラノシダーゼを生産する。GH51の酵素は、Geobacillus stearothermophilusのアラビノフラノシダーゼ (GsAbfA) で構造が明らかになっており、詳細な研究が進んでいる。一方、AkAbf54が属しているGH54の酵素については構造が決定されておらず、構造機能相関に関する研究は全く進んでいなかった。本研究では、このGH54に属するAkAbf54の構造解析及び機能解析を行った。AkAbf54の結晶構造解析とその全体構造 [1, 2]AkAbf54を大量発現させるため、発現系を構築した。大腸菌では発現量が少量であったが、Pichia酵母で発現させると大量のAkAbf54が得られた。酵母で発現させたAkAbf54には糖鎖が付加していたが、これを切断することなく結晶化に成功した。立体構造を重原子同型置換法 (MIR法) により分解能1.75 〓で決定した。また、アラビノース、アラビノフラノシル-α-(1,2)-キシロビオース (図1、AXX) との複合体構造をそれぞれ分解能2.07 〓、2.3 〓で決定した。AkAbf54は、図2に示すようにN末触媒ドメイン (Gly19-Val335) とC末ドメイン (Gly336-Ser499) の2つのドメインからなっていた。触媒ドメインのAsn202に糖鎖が結合していた。触媒ドメイン [2]触媒ドメインはβ-サンドイッチフォールドをとっており、GH7やGH16といったクランBに属する酵素と弱い構造上の相同性が見られた。負に強く荷電したポケットを持っており、アラビノースとの複合体ではこのポケットにアラビノース (Araf1) が結合していたことから、このポケットが触媒ポケットであると考えられた。Araf1は、水素結合及び疎水的相互作用により認識されていた。変異体を用いた実験及びGH51 GsAbfAとの構造比較などから触媒残基 (Nucleophile:Glu221、Acid/base:Asp297) を決定した。また、連続した2つのシステイン残基 (Cys176とCys177) からなるジスルフィド結合がアラビノースを疎水的に認識していた。さらに、このシステイン間のペプチド結合はシス結合になっていた。このようにシスペプチド結合で連なった連続するシステインのジスルフィド結合が糖を認識している例は他に報告されていない。アラビノース結合ドメインのCBM42への分類 [2, 3]アラビノースとの複合体構造を決定した際、アラビノースは触媒ドメインの他に、C末ドメインに2分子 (Araf2とAraf3) が結合していた。このことから、C末ドメインはCBMであると考えられ、アラビノース結合ドメインと名付けた。他のCBMは、触媒ドメインとの間にリンカーを持ち、触媒ドメインと離れた状態で存在するものが多いが、アラビノース結合ドメインはそれらとは異なり、リンカーを持たず、触媒ドメインと密に結合していた。アラビノース結合ドメインは、β-トレフォイルフォールドをとっていた。ドメイン内に3回繰り返し配列をもっており、αサブドメイン、βサブドメイン、γサブドメインに分けられる。各サブドメインは擬似3回軸で集まっており、サブドメイン間には構造上の相同性が見られた。このようなアラビノース結合ドメインのフォールドはCBM13と似ているものであったが、CBM13に見られるモチーフを持っていないなどの違いが見られた。このことから、アラビノース結合ドメインは新たに設置されたCBMファミリー (CBM42) に分類されることになった。以下、アラビノース結合ドメインをAkCBM42と略す。アミノ酸配列のアライメントを行ったところ、GH54に属する全ての酵素がCBM42に対応する部分を持っていることが分かった。この他、GH43にもCBM42と相同性を持つORFが見られた。アラビノースとの複合体構造では、Araf2がβサブドメインに、Araf3がγサブドメインに結合していた。β、γ各サブドメインポケットのアラビノース認識はほぼ同じであり、水素結合及び疎水相互作用により認識されていた。特に、アスパラギン酸とアラビノース間 (Asp435-Araf2、Asp488-Araf3) に見られるそれぞれ二つずつの水素結合が重要であると思われる。CBM13とは糖結合部位及び相互作用の様式が異なっていた。また、AXXとの複合体構造では、AXXはアラビノース複合体と同様にβサブドメインとγサブドメインに結合していた。側鎖アラビノース部分はアラビノース複合体と同様な認識を受けていた。一方、主鎖の糖にあたるキシロビオース部分とは弱い相互作用しかしていなかった。これまでに報告されているヘミセルロースに結合するCBMは主に主鎖の糖を認識するものばかりであるが、CBM42はこれらとは異なるタイプであった。AkCBM42の機能解析 [3]Asp435、Asp488の変異体を用いて、AkCBM42の詳細な機能解析を行った。不溶性の糖wheat arabinoxylanに対する活性を測定した。片方のアスパラギン酸を変異させると野生型と比較して5~10倍程度活性が低下し、両方のアスパラギン酸を変異させると50倍程度と活性が相乗的に低下した。このことから、AkCBM42は触媒ドメインの不溶性糖に対する活性を助けていることが分かった。一方、可溶性基質p-ニトロフェニルアラビノフラノシドに対する活性は、野生型と変異体で同様な活性を示した。結合アッセイを行ったところ、wheat arabinoxylanに結合した。アラビノース側鎖を除去したwheat arabinoxylanを作成したところ、全く結合しなかった。変異体で結合アッセイを行ったところ、片方のアスパラギン酸を変異させると結合能力が低下し、両方のアスパラギン酸を変異させると全く結合しなかった。また、様々な不溶性糖を用いてアフィニティゲル電気泳動を行った。アラビノース側鎖を持つarabinanにはアフィニティを示したのに対し、アラビノース側鎖を持たないdebranched arabinanではアフィニティは見られなかった。アラビノース側鎖が多く含まれているrye arabinoxylanでは特に高いアフィニティを示した。これらの結果は、AkCBM42はアラビノース側鎖を多く含む糖ほど結合力が高いことを示している。等温滴定カロリメトリー法を用いて、オリゴ糖に対する結合力測定を行った。AkCBM42は、アラビノース糖 (メチルアラビノフラノシドやアラビノトリオース) に対する結合定数は、2.0x103程度と他のCBMと比較して弱い値を示した。結合サイト数は2であり、片方のアスパラギン酸を変異させると結合サイト数が1に減少した。一方、キシロース糖 (メチルキシロピラノシドやキシロトリオース) に対しては結合が検出できなかった。このことはキシラン主鎖の結合サイトがないことを示している。これらのことから、CBM42は、(i) 糖結合ポケットを二つ持ち、この二つが不溶性糖に対する結合に働く、(ii) 図3に示すようにヘミセルロースのアラビノース側鎖一糖のみを認識する、(iii) 糖に対する結合定数が10の3乗程度と他のCBMと比較して弱い、といったユニークな性質を示すことが明らかになった。

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各種コード

  • NII論文ID(NAID)
    500000358064
  • NII著者ID(NRID)
    • 8000000359196
  • 本文言語コード
    • jpn
  • NDL書誌ID
    • 000008479598
  • データ提供元
    • 機関リポジトリ
    • NDL-OPAC
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