Porphyromonas gingivalisのピロリン酸依存型ホスホフルクトキナーゼ遺伝子のクローニング,遺伝子発現および性状解析について Cloning, Expression, and Characterization of Pyrophosphate-Dependent Phosphofructokinase Gene from Porphyromonas gingivalis

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抄録

Porphyromonas gingivalisは,グラム陰性嫌気性桿菌であり,一般に糖分解を行わない細菌として知られている。今回P. gingivalis381株におけるピロリン酸依存型ホスホフルクトキナーゼ(PPi-PFK)をコードする遺伝子(PgPFK)のクローニング,塩基配列の決定,および遺伝子発現を行い,その性状解析を行った。PgPFKは1,650bpからなり,550アミノ酸,分子量61,044 Da,等電点5.52,二量体のタンパクであることが明らかとなった。ホモロジー検索の結果,解糖系のkey enzymeであるPFKのうち,62kDa Borrelia burgdorferi PFK (50%),Treponema pallidurn β-subunit(52%),などのPPi-PFKと高い相同性を示した。アミノ酸配列を詳細に比較検討したところ,PPi-PFKに共通して認められるモチーフ(GGDD,TIDXD,MGR)およびbinding sitesのほとんどが保存されていることが明らかとなった。また塩基配列をもとにPFKの分子系統樹を作製したところ,PFKは4群に分類されることが確認され,PgPFKは60〜62 kDaの分子量をもつlong sequence typeに属し,それらはcoherentなclusterを形成していることが明らかとなった。PgPFK遺伝子を組み込んだプラスミド(pET 21 a-PgPFK)を構築し,E. coli BL 21(DE3)株を用いて組み換えPgPFKの発現誘導および精製を行い,得られた精製タンパクの性質を調べた結果,ほかのPPi-PFK同様,fructose 6-phosphate からfructose 1,6-bisphosphateへの反応は可逆的であること,PFK活性はMs^<2+>依存性でありATPやfructose 2,6-bisphosphate等の影響を受けないことが明らかとなった。またRT-PCR分析を行い,PgPFK遺伝子がmRNAレベルで発現していることを確認した。以上の結果からPgPFKが典型的なPPi-PFKに属し,その性質もいままでに報告されているPPi-PFKと非常に類似していることが明らかになった。糖新生系の一酵素であるfructose 1,6-bisphosphataseがP. gingivalisの遺伝子データベース上に検索されないことからPgPFKがその代役を果たしている可能性が考えられる。

We have cloned, sequenced, and expressed the gene encoding a pyrophosphate (PPi)-dependent-phosphofructokinase (PFK) (EC 2.7.1.90), designated PgPFK, from Porphyromonas gingivalis 381. The PgPFK gene consisted of 1,650 bp which coded for a protein of 550 amino acids with a calculated molecular mass of 61,044 Da. The deduced amino acid sequence of PgPFK exhibited a significant similarity to the 62 kDa PPi-PFKs from Borrelia burgdorferi and Treponema pallidum PFKβ-subunit. Most of the amino acid residues shown or assumed to be involved in substrate binding in other PPi-PFKs were conserved in PgPFK. Recombinant PgPFK was purified to homogeneity and characterized. The purified enzyme was found to be enzymatically active when it was expressed in Escherichia coli and was not regulated by classical effectors of ATP-dependent PFKs (ATP-PFKs) (EC 2.7.1.11) such as ATP, ADP, or fructose 2,6-bisphosphate like the known PPi-PFKs. Reverse transcriptase polymerase chain reaction analysis revealed that the PgPFK gene was expressed in P. gingivalis. Phylogenetic analysis showed that the long sequence type group of PPi-PFKs including PgPFK formed a coherent cluster like the ATP-PFK family. These results suggest that PgPFK is one of the most typical of PPi-PFK functioning in P. gingivalis. Moreover, it seems that this organism might not have any fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase). From these results we propose that PgPFK serves as a FBPase in the gluconeogenic direction.

収録刊行物

  • 口腔衛生学会雑誌

    口腔衛生学会雑誌 51(3), 281-292, 2001

    一般社団法人 口腔衛生学会

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各種コード

  • NII論文ID(NAID)
    110004017901
  • NII書誌ID(NCID)
    AN00081407
  • 本文言語コード
    ENG
  • 資料種別
    ART
  • ISSN
    0023-2831
  • データ提供元
    CJP書誌  NII-ELS  J-STAGE 
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