リポ蛋白リパーゼの活性発現機構に関する研究 A Study of Catalytic Function and Structure of Lipoprotein Lipase.

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著者

    • 田代 淳 TASHIRO Jun
    • 千葉大学医学部 2nd Department of Internal Medicine, School of Medicine, Chiba University

抄録

リポ蛋白リパーゼ(LPL)は血中中性脂肪を加水分解する酵素であり,その活性低下は高中性脂肪血症の原因となる。近年,本酵素活性低下の原因として機能異常LPLの存在が見出され,その機能異常是正により高度中性脂肪血症の治療が可能となった症例が報告された。このような機能異常LPLを見出し治療法を検討するためには,LPL活性発現機構の詳細を明らかにする必要がある。本研究ではヒトLPL反応機構の詳細と活性中心構造について検討した。リパーゼ反応の特徴は,水に溶けた酵素と水に溶けていない基質との異相聞反応ということである。したがって酵素はエステル結合水解に関わる活性中心機能以外に,基質が形成する界面を認識,結合する機能をそなえていると考えられる。また,一般にリパーゼは本来の長鎖脂肪酸エステル水解活性(lipase活性)以外に水溶性の短鎖脂肪酸エステル水解活性(esterase活性)を持つ。本研究では,LPLは界面認識部位と活性中心とを別に持ち,活性中心機能はesterase活性でモニターできるという機能モデルを想定し解析を行った。ヒトLPL cDNAから発現されたLPLは,lipase活性(triolein水解活性)とesterase活性(tributyrin水解活性)を有した。そのtriolein水解活性はtributyrin添加により低下した。一方,LPLのtributyrin水解活性はtriolein emulsion添加により増加した。これはLPLが脂質界面と結合した時活性中心に構造変化が生したためであり,いわゆるinterfacial activationと考えられた。この過程がリパーゼ活性発現に果たす意義を明らかにするため,LPL蛋白をtrvosin処理し検討した。 LPLをtrvosin処理してもtributyrin水解活性と脂質粒子との結合能は保持されていた。しかしtriolein添加によるtributyrin水解活性上昇反応はみられず,triolein水解活性は認められなかった。以上からinterfacial activationはlipase活性発現に必須な過程と考えられた。次に活性中心構造の解析を変異LPLを作製し検討した。活性中心は他のリパーゼとの1次構造の比較からserine (Ser, S)^<132>が重要と推測されている。このSer^<132>をasparagine (Asn, N)とglycine (Gly, G)に置換させたLPLについて解析した。LPL-S132Nは超低比重リポ蛋白との結合は認められたが, triolein, tributyrin水解活性共に認められなかった。LPL-S132Gはtriolein, tributyrin水解活性いずれもwild type LPLと同等に有していた。以上からLPLのSer132は脂質界面との結合に関与せず,活性中心にとって重要と思われた。しかしGlyに置換しても活性は保持されることが明らかとなった。

We studied the catalytic process of lipoprotein lipase (LPL) and the structure which affects the catalytic activity of LPL. LPL was expressed in CHO cells transfected with human LPL cDNA. The LPL retained tributyrin, water-soluble substrate, hydrolyzing activity (esterase activity). The catalytic action of LPL was studied by monitoring the esterase activity. The esterase activity was enhanced 4.5-fold by the addition of triolein emulsion. This process was named interfacial activation. Treatment of LPL with trypsin caused the loss of the triolein hydrolyzing activity. The esterase activity of trypsin-treated LPL was not enhanced by the addition of the triolein emulsion. The trypsin-treated LPL retained the ability to bind to very density lipoproteins. These results are consistent with an idea that LPL has a catalytic site and a lipid interface recognition site, and that the enzyme undergoes interfacial activation, in which the concealed catalytic site is revealed after the enzyme binds to the surface. Based this hypothesis, the present results suggested that trypsin-nicking may impair the interfacial activation process and cause the loss of the lipase activity, and that interfacial activation may be necessary for catalytic actions of lipase. Next, for studying the role of Ser (S)^<132> in the putative catalytic site of human LPL, mutant LPL cDNA expressing LPLs with amino acid substitution of Asn (N) or Gly (G) for Ser^<132> were obtained and were expressed in COS-1 cells. Considerable amounts of LPL enzyme protein mass were detected in the culture medium of the COS-1 cells transfected with wild type LPL, LPL-S132N or LPL-S132G. LPL-S132N showed no activity against triolein or tributyrin, whereas the mutant LPL bound to very low density lipoproteins as effectively as wild type LPL. The result indicated that Ser^<132> is important for the catalytic activity of human LPL, but not for binding to lipid interface. Whereas, LPL-S132G hydrolyzed triolein and tributyrin, indicating that the Ser^<132> is contained in the structure of which the substitution of glycine for Ser^<132> can retain the catalytic activity of LPL.

収録刊行物

  • 千葉医学雑誌

    千葉医学雑誌 70(6), 403-415, 1994-12-01

    千葉大学

各種コード

  • NII論文ID(NAID)
    110004647768
  • NII書誌ID(NCID)
    AN00142148
  • 本文言語コード
    JPN
  • 資料種別
    Journal Article
  • ISSN
    03035476
  • データ提供元
    NII-ELS  IR 
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