ヒトRAD18はPCNAのモノユビキチン化に依存しないでS期特異的DNA単鎖切断修復に働く Human RAD18 is involved in S phase-specific single-strand break repair without PCNA monoubiquitination

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抄録

ヒトRAD18遺伝子は、酵母の損傷トレランスに関わるRAD6エピスタシス遺伝子群に属するRAD18遺伝子のヒトホモログとして単離された。RAD18は、生化学的にはユビキチンリガーゼでユビキチン結合酵素のRad6と複合体を形成して働く。最近、RAD18/RAD6はDNA損傷による複製停止部位でPCNAをモノユビキチン化し、それにより複製DNAポリメラーゼから損傷乗り越えポリメラーゼへのスイッチングに関与することが明らかにされてきた。 我々は,RAD18のヒト細胞内での働きを詳細に調べるため,ヒトHCT116細胞から標的遺伝子破壊法によりRAD18遺伝子を破壊したRAD18欠損細胞株を樹立し,その性質を調べてきた。RAD18欠損細胞は電離放射線にやや高感受性(細胞の生存および染色体異常の誘発について)だが、DNA二本鎖切断修復の相同組み換え修復(HR)と非相同末端結合修(NHEJ)の主経路は機能しているので、RAD18はHRやNHEJとは別の修復経路で働くと考えられた。さらに、RAD18欠損細胞は単鎖切断を誘発するカンプトテシン(CPT)には感受性が高いが二本鎖切断を誘発するエトポシドにはそれほど感受性が高くないことからDNAの単鎖切断修復が欠損していると考えられた。また、CPTに対する高感受性は細胞周期のS期に限定されることやアルカリコメット法でS期での単鎖切断修復能が欠損していることが明らかとなったので、RAD18はS期特異的な単鎖切断修復に関与すると考えた。 これらの結果および電離放射線照射やCPT処理ではHCT116細胞においてもPCNAのモノユビキチン化は起きないことから、S期特異的な単鎖切断修復においてはポリメラーゼのスイッチングでは重要であったPCNAのモノユビキチン化は必要ないものと考えられた。

Switching from a replicative to a translesion polymerase is an important step to further continue on replication at the site of DNA lesion. Recently, RAD18 (a ubiquitin ligase) was shown to monoubiquitinate proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in cooporation with RAD6 (a ubiquitin-conjugating enzyme) at the replication-stalled sites, causing the polymerase switch. Analyzing RAD18-knockout (RAD18-/-) cells generated from human HCT116 cells, in addition to the polymerase switch, we found a new function of RAD18 for S phase-specific DNA single-strand break repair (SSBR). Unlike the case with polymerase switching, PCNA monoubiquitination was not necessary for the SSBR. When compared with wild type HCT116 cells, RAD18-/- cells, defective in the repair of X-ray-induced chromosomal aberrations, were significantly hypersensitive to X-ray-irradiation and also to the topoisomerase I inhibitor camptothecin capable of inducing single-strand breaks but were not so sensitive to the topoisomerase II inhibitor etoposide capable of inducing double-strand breaks. However, such hypersensitivity to camptothecin observed with RAD18-/- cells was limited to only the S phase due to the absence of the RAD18 S-phase-specific function. Furthermore, the defective SSBR observed in S phase of RAD18-/- cells was also demonstrated by alkaline comet assay.

収録刊行物

  • 日本放射線影響学会大会講演要旨集

    日本放射線影響学会大会講演要旨集 2007(0), 43-43, 2007

    Journal of Radiation Research 編集委員会

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