グラム陰性菌 Campylobacter jejuni 由来 PglB オリゴ糖転移酵素による合成基質を用いた N-グリコシル化に関する研究  [in Japanese] Study on N -glycosylation of synthetic substrates by PglB oligosaccharyltransferase from Gram-negative bacterium Campylobacter jejuni  [in Japanese]

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Abstract

<p> グラム陰性菌Campylobacter jejuni より見いだされたN-結合型糖タンパク質糖鎖は、ほ乳類とは全く異なる構造Glc<sub>1</sub>GalNAc<sub>5</sub>Bac<sub>1</sub>であり、還元末端の4,6-diacetamido- 2,4,6-trideoxy-D-glucose (bacillosamine, Bac) を有するオリゴ糖鎖がタンパク質側のAsnを介しタンパク質に結合した構造として同定された。C. jejuniは、カンピロバクター感染症の原因菌の一つで、食中毒を引き起こすのみならず、その後遺症として非常に深刻な自己免疫疾患であるギランバレー症候群 (GBS) を C. jejuni の細胞壁リポ多糖が原因で引き起こすとされている。GBSは重傷化し易く、非常に厄介なものであり、注目されている細菌である。現在までにタンパク質への糖鎖の付加が、感染初期段階の接着に重要であることが見い出されており、その生合成と併せてこのN-結合型糖タンパク質構造はとても興味深い。N-結合型糖タンパク質の生合成 (Fig.1, 2) は、まず内膜のサイトプラズム側で脂質を介し結合したオリゴ糖がピロリン酸として構築され、ペリプラズム側に反転した後にPglBオリゴ糖転移酵素 (OST) により捕捉、活性化され、ペプチド基質へオリゴ糖を転移し達成される。</p><p> 私達はすでに、N-結合型糖タンパク質生合成に関わる複合糖質の合成研究の一環として、ペンタフルオロプロピオニル(PFP)基 [2] を利用した、1,2-cis-a- GalNAc 繰り返し構造の立体選択的構築法 [3]、Bac [4] の合成法、グリコシルアミンのalloc体を経由したグリコシルアスパラギン合成法 [5] を用いたBacAsn構造の構築 [4] 等合成研究をすすめ、7糖Glc<sub>1</sub>GalNAc<sub>5</sub>Bac<sub>1</sub>の合成に成功している [6]。今回、グラム陰性菌由来オリゴ糖転移酵素によるタンパク質の糖転移反応について検討するために、糖脂質基質の合成検討とペプチド基質の合成、および糖転移反応について検討したので、報告する。</p><p>1. 糖転移酵素基質の合成</p><p>まず、タンパク質への PglB OSTの基質および生合成中間体として重要なウンデカプレニルピロリン酸エステル類 (1, 2) および、コンセンサス配列をもつペプチド基質 (4) の合成を検討した。</p><p>1.1 ([E]<sub>3</sub>,[Z]<sub>7</sub>)-undecaprenolの合成</p><p> trans,trans-farnesol および nerol から出発し、佐藤らのポリプレノール合成 [7] を参考に、7と10より11を経て12へ、8と9より13へと誘導した。合成した12と13との同様なカッリング–還元反応にてC. jejuni 由来 undeca- prenol (Und-OH) 14の合成に成功した [8]。引き続く3工程にてundecaprenyl phosphate (Und-P) 15を得た(Sch. 1)。</p><p>1.2 オリゴ糖部の合成</p><p> オリゴ糖部の合成に関しては、既に合成の完了している Bac 誘導体 16 より、ペンタフルオロプロピオニル (PFP) 基を有する糖供与体 17 を用いる立体選択的グリコシル化–脱保護を繰り返し (16a18 a19, 19a20a 21)、GalNAc<sub>2</sub>Bac (21) を立体選択的、かつ簡便に得た (Sch. 2)。得られた 21 よりアセトアミド基への変換 (21 a23)、peracetateへの変換 (23a 26)、および還元末端の選択的脱保護により、オリゴ糖部27の合成を完了した [8]。同様に16よりアセトアミド基へ変換し (16a29)、アセチル化後に (29a31)、還元末端をヘミアセタールとし Bac誘導体32を合成した [8]。</p><p>1.3 脂質</p><p>(View PDFfor the rest of the abstract.)</p>

<p>The oligosaccharyltransferase(OST) PglB from Campylobacter jejuni catalyses the N-glycosylation reaction with undecaprenyl pyrophosphate-linked Glc<sub>1</sub>GalNAc<sub>5</sub>Bac<sub>1</sub>(Und-PP-Glc<sub>1</sub>GalNAc<sub>5</sub>Bac<sub>1</sub>) (Fig. 1,2) [1]. In this study, we conducted in vitro N-glycosylation of peptidicsubstrates using chemically synthesized donors for systematic analysis of bacterial protein N-glycosylation. </p><p>In addition to previous synthetic study on bacterial N-glycan [2–6], ([E]<sub>3</sub>,[Z]<sub>7</sub>)-undecaprenolwas synthesized (Sch. 1), and was converted to undecaprenyl phosphate (Und-P) [7]. The stereoselectivelypreparation of glycan moieties using PFP-protected GalN<sub>3</sub> donor [3] and Bac derivative [6] was followed by the conversion to glycosyl phosphates (Sch. 2) [7]. Und-P was coupled with resultants glycosyl phosphates to afford Und-PP-Bac<sub>1</sub> (1) as Und-PP-GalNAc<sub>2</sub>Bac<sub>1</sub>(2) (Sch. 3) [7]. The fluorescent tag-modified peptides acceptor possessing the consensus sequence (D/E-X'-N-X-T/S, X',X ≠P) has been obtained from mono-Boc protected linker using Fmoc-strategy (Sch. 4) [9]. </p><p>Analysis of N-glycosylation catalyzed by PglBOST [10] using chemically synthesized donors and peptide acceptor (Sch. 5) confirmed that biosynthetic intermediates were transferred efficiently to the Asnresidue embedded in the consensus sequence [9]. The products were analyzed in detail by tandem MS to confirm their chemical structures. Our results would suggest that the membrane compartmentalization and PglK flippase [11] (Fig. 1) might be essential for the precise heptasaccharidemodification of glycoproteins. </p>

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  • Symposium on the Chemistry of Natural Products, symposium papers

    Symposium on the Chemistry of Natural Products, symposium papers 57(0), PosterP44, 2015

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