Studies on tumor necrosis factor-α and its receptor in bovine corpus luteum ウシ黄体における腫瘍壊死因子ならびにそのレセプターに関する研究

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著者

    • 作本, 亮介 サクモト, リョウスケ

書誌事項

タイトル

Studies on tumor necrosis factor-α and its receptor in bovine corpus luteum

タイトル別名

ウシ黄体における腫瘍壊死因子ならびにそのレセプターに関する研究

著者名

作本, 亮介

著者別名

サクモト, リョウスケ

学位授与大学

岡山大学

取得学位

博士 (農学)

学位授与番号

甲第2069号

学位授与年月日

2000-03-25

注記・抄録

博士論文

The objective of this study was to investigate the physiological roles of tumor necrosis factor α (TNFα) in bovine corpus luteum (CL) function throughout the estrous cycle and the entire gestation period. In the first series of experirnents, the expression of TNFα, the presence of functional TNFα receptors, and the expression of TNF receptor type I (TNF-RI) mRNA in the CL during different stages of the estrous cycle were examined. RT-PCR showed no difference in TNFα mRNA expression during the estrous cycle. Concentrations of TNFα in the CL tissue increased significantly from the mid- to the late luteal stage and decreased thereafter. A RT-PCR analysis showed higher levels of TNF -RI mRNA in CL of days 3-7 than in other stages. (125)I-TNFα binding to the membranes of bovine CL was maximal after incubation at 38 C for 48 h. The binding was much greater for TNFα than for related peptides. A Scatchard analysis revealed the presence of a high-affinity binding site in the CL membranes collected at each phase of the estrous cycle (dissociation constant (Kd); 3.60±0.58 - 5.79±0.19 nM). In contrast to TNF-RI mRNA expression, the levels of receptor protein were similar at each stage in the estrous cycle. When cultured cells of all luteal stages were exposed to TNFα (0.06-6 nM), TNFα stimulated prostaglandin (PG) F2α and PGE2 secretion by the cells in a dose-dependent fashion, especially during the early luteal phase, although it did not affect progesterone secretion. In the second series of experiments, the presence of TNFα mRNA and TNFα receptors in the bovine CL during the gestation period were investigated. The presence of TNFα mRNA and TNFα receptors on bovine CL from pregnant cows was investigated at three stages: trimesters I, II and III. TNFα mRNA was detected by an RT-PCR analysis in the CL of all stages of gestation. A Scatchard analysis revealed the presence of a high-affinity binding site (Kd; 5.1-6.9 nM) in the CL membranes collected at each stage of gestation. Furthermore, the concentrations of TNFα receptors in the CL of trimesters I (24.0± 1.95 pmol/mg protein) and III (21.6±2.39 pmol/mg protein) of gestation were significantly higher than the concentration in trimester II (14.9±2.07 pmol/mg protein). In the third series of experiments, I investigated the presence of functional TNFα receptors on the microvascular endothelial cells derived from developing bovine CL. TNFα receptors were analyzed by a radioreceptor assay using (125)I-labeled TNFα on two types of cultured endothelial cells. One has a cobblestone appearance (CS cells), and the other has a tube-like structure (TS cells). (125)I-labeled TNFα binding was maximal after incubation for 30 h at 37 C, and the specificity of binding was confinned. A Scatchard analysis showed the presence of two binding sites (high- and low- affinity) for TNFα receptors on both CS and TS cells. The Kd values and concentrations of the high-affinity binding sites for TNFα receptors were similar between CS and TS cells. However, Kd values and concentrations of the low-affinity binding sites in CS cells were significantly higher than those in TS cells. The expression of TNF-RI mRNA was determined in both cell types. Furthermore, TNFαsignificantly stimulated PGE2 and endothelin-1 secretion by both CS and TS cells. The final series of experiments were conducted to clarify the intracellular signaling pathway of TNFα to stimulate PGF2α production in cultured bovine luteal cells. Bovine luteal cells that were obtained from mid- (days 8-12 after ovulation) CL were incubated with TNFα (0.6 nM) and/or various compounds as follows: U-73122 (a phospholipase (PL) C inhibitor), ACA (a PL-A2 inhibitor), H-89 (a protein kinase (PK) A inhibitor), calphostin C (a PK-C inhibitor), L-NAME/L-NORG (a nitric oxide synthase inhibitor), PD98059 (a mitogenactivatedprotein kinase (MAPK) kinase inhibitor). U-73122 (0.1-10 μM), H-89 (0.1-10 μM), calphostin C (0.01-1 μM) and L-NAME/L-NORG (1-100 μM) did not affect TNFα-induced PGF2α secretion by the cultured cells. In contrast, ACA (1-100 μM) and PD98059 (0.1-100 μM) inhibited TNFα-stimulated PGF2α secretion by the cells in a dose-dependent fashion. The overall results in the present study indicate the local production of TNFα and the presence of functional TNF-RI in bovine CL throughout the estrous cycle and entire gestation period, and suggest that TNFα plays some roles as a paracrine factor in regulating bovine CL function. Furthermore, the present results indicate the presence of two types of TNF receptors and the expression of TNF-RI mRNA in the endothelial cells derived from bovine CL, suggesting TNFα plays two or more roles in regulating the secretory function of the endothelial cells. Finally, the present study also showed that the stimulatory effect of TNFα on PGs secretion by bovine luteal cells might be mediated via activation of the MAPK and PL-A2 pathways.

腫瘍壊死因子(TNFα)は主にマクロファージで産生されることの知られるサイトカインの一つである。近年、雌性生殖機構、特に、黄体退行機構へのTNFαの関与が注目されているが、その詳細は明らかでない。本研究では、ウシ黄体におけるTNFαの生理的役割を知るための基礎研究として、発情周期ならびに妊娠期におけるウシ黄体のTNFαおよびその特異的なレセプターについて多角的に検討するとともに、局所機能調節因子としてのTNFαの生理的役割を知るためにウシ黄体の内分泌機能におよぼすTNFαの影響について調べた。その結果、以下のような新しい知見を得た。1)周期性黄体におけるTNFαとそのレセプター ウシ黄体を、肉眼的所見から形成初期(days 2-3)、形成後期(days 5-6)、中期(days 8-12)、後期(days 15-17)ならびに退行期(days 19-21)に分類した。黄体組織からtotal RNAを抽出した後、reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)法を用いて、TNFα mRNAならびにTNFレセプター・タイプI(TNF-RI)mRNA発現を調べた.また、黄体組織中のTNFα濃度は、ヒトTNFα ELISAキットを用いて検討した。さらに、黄体組織から常法に従い作成した膜分画について、(125)I-標識TNFαを用いてラジオレセプターアッセイ(RRA)を行い、Scatchard解析によりTNFαレセプターの濃度ならびに親和性を求めた。その結果、黄体内のTNFα mRNA発現量は発情周期を通じて有意な変化は見られなかったが、TNFαの濃度は発情周期にともなって増加し、後期ならびに退行期に高い値を示した(p<0.05)。また、発情周期を通じて黄体にTNF-RI mRNAの発現が見られ、さらにTNFαに特異的な結合部位(Kd; 3.6-5.8 nM)の存在することが明らかとなった。次に、黄体に存在するTNFαレセプターが機能的であるかどうか知る目的で、形成後期、中期ならびに後期の黄体から灌流法により採取した黄体細胞を培養し、培養24時間後に培養液を交換した後、TNFα(0.06-6 nM)で24時間処理した。培養液中のプロジェステロン(P4)、プロスタグランジン(PG)F2αならびにPGE2濃度をエンザイムイムノアッセイにより測定した。その結果、形成後期、中期および後期のいずれの黄体より採取した培養細胞においても、PGF2αならびにpGE2分泌は、TNFαによって有意に促進されたが、p4分泌には影響が見られなかった。2)妊娠黄体におけるTNFαとそのレセプター ウシ黄体のステージを、胎児の頭尾体長より妊娠初期(<90日)、中期(90-180日)ならびに後期(>180日)に分類した(各n=6)。黄体組織からtotal RNAを抽出した後、RT-PCRを行い、TNFα mRNA発現を調べた。一方、黄体組織から作成した膜分画についてRRAを行い、Scatchard解析によりレセプターの濃度ならびに親和性を求めた。その結果、いずれのステージの妊娠黄体にもTNFα mRNAの発現が見られたが、その発現量にステージによる差は認められなかった。また、いずれのステージの妊娠黄体にもTNFαに特異的な結合部位が存在し、その濃度は妊娠初期(24.0±1.9 pmol/mg protein)ならびに妊娠後期(21.6±2.4 prmol/mg)に高く、中期(14.9±2.1 pmol/mg)に低かった。3)黄体由来血管内皮細胞におけるTNFα とそのレセプタ- 実験1)、2)より、ウシ黄体にTNFαならびにその特異的なレセプターの存在することが明らかとなった。しかし、黄体を構成する細胞は黄体細胞だけでなく、血管内皮細胞、繊維芽細胞といったその他の細胞も多く、上記の研究では黄体細胞以外の細胞でのTNFαの生理作用について明確にできなかった。そこで、本研究では黄体の約50%以上を構成する血管内皮細胞におけるTNFαレセプタ-ならびにその生理的意義について検討した。ウシ黄体から単離した2種類の血管内皮細胞(CS cellsとTS cells)を培養し、RRAならびにRT-PCR により、TNFαレセプターの存在について検討した。その結果、CSおよびTS cellsともに2つの異なる親和性をもつTNFαレセプターならびにTNF-RI mRNAの存在することが示された。さらに、細胞培養法による刺激試験から、TNFαが血管内皮細胞のエンドセリン-1ならびにPGE2分泌を濃度依存的に増加させることが明らかとなった。4)TNFαの黄体細胞内シグナル伝達機構 実験1)において、TNFαが培養黄体細胞のPGF2α分泌を促進することが明らかになった。TNFαは様々な細胞内シグナル伝達機構を介して作用することが知られているが、黄体細胞での機構には不明な点が多い。本研究では、種々の細胞内シグナルに関与する物質の特異的阻害剤を用いて、TNFαの黄体細胞内シグナル伝達機構について検討した。ウシ中期黄体細胞を常法に従い培養し、種々の細胞内シグナル伝達阻害剤とTNFαを組み合わせて添加した後の、PGF2α分泌量の変化を調べた。その結果、TNFαによる黄体細胞のPGF2α分泌促進効果は、phospholipase (PL) A2ならびにmitogen activated protein kinase (MAPK)の特異的阻害剤により濃度依存的に抑制された。このことから、TNFαはPL-A2およびMAPKを介してPGF2α分泌を促進する可能性が示唆された。以上の研究から、発情周期だけでなく妊娠期を通じてウシ黄体にTNFαならびにその特異的なレセプターの存在することが明らかとなり、TNFαは局所機能調節因子として、黄体退行機構だけでなく、発情周期、妊娠期を通じてのウシ黄体機能調節にも関与することが示唆された。また、ウシ黄体由来血管内皮細胞にも特異的なTNFαレセプターの存在することが明らかとなったことから、TNFαは黄体内局所調節因子として、黄体細胞のみならず血管内皮細胞の内分泌機能にも作用して、オートクラインならびにパラクライン的にウシ黄体機能調節に関与することが示唆された。

目次

  1. CONTENTS / p3 (0005.jp2)
  2. PREFACE / p1 (0003.jp2)
  3. ACKNOWLEDGMENTS / p2 (0004.jp2)
  4. CONTENTS / p3 (0005.jp2)
  5. LIST OF TABLES / p5 (0007.jp2)
  6. LIST OF FIGURES / p6 (0008.jp2)
  7. ABSTRACT / p8 (0010.jp2)
  8. INTRODUCTION / p1 (0012.jp2)
  9. CHAPTER 1.GENERAL METHODOLOGY / p3 (0014.jp2)
  10. Chemicals / p3 (0014.jp2)
  11. Collection of Bovine Corpora Lutea / p3 (0014.jp2)
  12. Preparation of Luteal Cells / p3 (0014.jp2)
  13. RNA Isolation / p4 (0015.jp2)
  14. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) / p4 (0015.jp2)
  15. Membrane Preparation / p5 (0016.jp2)
  16. Radioreceptor Assay(RRA) / p6 (0017.jp2)
  17. Hormone Determination / p6 (0017.jp2)
  18. Statistical Analysis / p7 (0018.jp2)
  19. CHAPTER 2.TUMOR NECROSIS FACTOR-α AND ITS RECEPTOR IN BOVINE CORPUS LUTEUM THROUGHOUT THE ESTROUS CYCLE / p9 (0020.jp2)
  20. Materials and Methods / p9 (0020.jp2)
  21. Results / p10 (0021.jp2)
  22. Discussion / p19 (0030.jp2)
  23. Summary / p21 (0032.jp2)
  24. CHAPTER 3.TUMOR NECROSIS FACTOR-α AND ITS RECEPTOR IN BOVINE CORPUS LUTEUM DURING THE GESTATION PERIOD / p22 (0033.jp2)
  25. Materials and Methods / p22 (0033.jp2)
  26. Results / p23 (0034.jp2)
  27. Discussion / p27 (0038.jp2)
  28. Summary / p28 (0039.jp2)
  29. CHAPTER 4.TUMOR NECROSIS FACTOR-α RECEPTORS IN MICRO-VASCULAR ENDOTHELIAL CELLS FROM BOVINE CORPUS LUTEUM / p30 (0041.jp2)
  30. Materials and Methods / p31 (0042.jp2)
  31. Results / p32 (0043.jp2)
  32. Discussion / p39 (0050.jp2)
  33. Summary / p40 (0051.jp2)
  34. CHAPTER 5.INTRACELLULAR SIGNALING PATHWAYS OF TUMOR NECROSIS FACTOR-α IN BOVINE LUTEAL CELLS / p42 (0053.jp2)
  35. Materials and Methods / p42 (0053.jp2)
  36. Results / p43 (0054.jp2)
  37. Discussion / p48 (0059.jp2)
  38. Summary / p49 (0060.jp2)
  39. CONCLUSION / p50 (0061.jp2)
  40. REFERENCES / p51 (0062.jp2)
  41. ABSTRACT IN JAPANESE / p58 (0069.jp2)
3アクセス

各種コード

  • NII論文ID(NAID)
    500000189330
  • NII著者ID(NRID)
    • 8000000189613
  • DOI(NDL)
  • 本文言語コード
    • eng
  • NDL書誌ID
    • 000000353644
  • データ提供元
    • 機関リポジトリ
    • NDL ONLINE
    • NDLデジタルコレクション
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