ダブルローリングサークル複製は高頻度組換えを伴う

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著者

    • 岡本, 治子 オカモト, ハルコ

書誌事項

タイトル

ダブルローリングサークル複製は高頻度組換えを伴う

タイトル別名

著者名

岡本, 治子

著者別名

オカモト, ハルコ

学位授与大学

総合研究大学院大学

取得学位

博士 (理学)

学位授与番号

甲第1437号

学位授与年月日

2011-03-24

注記・抄録

博士論文

&nbsp; &nbsp; 本研究では、ダブルローリングサークル複製(double rolling-circle replication, DRCR)が極めて高頻度の組換えを起こすプロセスであることを強く示唆する結果を得たので、ここに報告する。<br/>&nbsp; &nbsp; 我々の研究室では、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いて遺伝子増幅の分子機構を明らかにする目的で研究を行ってきた。遺伝子増幅とは染色体上のある領域のコピー数が上昇する現象である。ヒトのがん遺伝子や、薬剤耐性遺伝子などで遺伝子増幅が起きる事はよく知られている。これまで増幅の過程を明らかにしようと得られた増幅産物の構造解析がなされてきたが、余りに複雑であるため、解明に成功していない。そのため我々の研究室では遺伝子増幅がダブルローリングサークル複製(DRCR)によると仮定した増幅系を構築し、働かしたところ、動物細胞による遺伝子増幅産物と酷似した産物を得ることに成功した。この産物の構造を解析した結果、予想外の構造変化が起きている事が判明した。つまり逆位反復配列(→←)間の反転(inversion)が、高頻度で起きていたのである。通常の複製において高頻度の反転が起きることはまれであり、謎として残された。<br/>&nbsp; &nbsp; そこで本研究では、この高頻度の反転を含む相同組み換え全般とDRCRとの関係を明らかにすることを目指した。材料として、自然界でDRCRによって増える出芽酵母の2ミクロンプラスミドを用いた。このプラスミドは部位特異的組換え系として、Cre-lox系に類似したFlp1-FRT系を有する。このFlp1-FRT系の組み換えに伴い複製フォークの進行方向が変わることによりDRCRが誘導される。この組換え系が欠損するとDRCRは抑えられ、通常の複製のみが起きる。そのためこの系を用いれば、高頻度組換え現象がDRCR依存的に起きるかどうかを調べることが出来る。まず、反転反応が活性化されるかを調べるためにトランスポゾンのTn5を利用した。Tn5は、中央のユニーク配列を挟んで、逆位一対のIS50と呼ばれる断片が挟む構造を有する。このTn5を2ミクロンプラスミドに挿入し、反転の頻度を調べた。その結果、野生型2ミクロンプラスミドでは高頻度の反転が起こったが、Flp1-FRT系組換え系が欠損した場合は、反転は全く起こらなかった。次に他の組換えの反応である欠失や重複についても調べた。そのために先の2ミクロンプラスミド上のTn5の構造の内、逆位にあるIS50の一つを人工的に反転することで、直列反復配列(→→)を有するTn5の誘導体を作成して調べた。その結果、野生型2ミクロンプラスミドでは高頻度の欠失および重複が確かに生じたのに対し、Flp1-FRT系組換え系が欠損した場合は、そのような組換えは全く起こらなかった。以上の結果から2ミクロンプラスミドにおいては、反転、欠失および重複という全てのタイプの相同組換えがDRCR依存的に著しく活性化されることが明らかとなった。上述したように、以前出芽酵母染色体に誘導したDRCRによって、高頻度に反転反応を活性化されることを見てきた。そこで、ここでは欠失および重複反応も同様に活性化されるかどうかを検証した。染色体上でDRCRを誘導する系は以前開発したものを用いた。染色体上でDRCRによって増幅する産物は2種類あり、動物細胞での産物であるHSR (homogeneously staining region) とDMs (double minutes)に酷似している。以前と異なるのは、増幅ユニット内に直列反復配列(→→)を挿入したことである。増幅後HSRタイプの産物を制限酵素と電気泳動により解析したところ、増幅ユニットのメインバンドに加え、欠失および重複によるバンドがメインバンドの上下に認められた。それに対しコントロールの産物では認められなかった。このことから染色体上でも、直列反復配列間の欠失および重複はDRCR依存的に起きることが判明した。今回の研究により、何れのゲノムにおいても、反転、欠失、重複という全てのタイプの組換えの活性化とDRCRが分離できなかった。<br/>&nbsp; &nbsp; 今回見出されたDRCR依存的な高頻度組換えにはどのような生物学的意義があるのだろうか。染色体上でDRCRによって増幅した領域は、巨大なパリンドローム構造をとる。このような構造は不安定であると予想され、反転反応はその安定化に寄与していることが考えられる。一方、動物培養細胞において観察されてきたことだが、増幅初期の染色体上では長大な増幅ユニットであったものが、選択圧が増すにつれてユニットの短小化と目的遺伝子のコピー数の増加が急激に起こる。しかしこれらの急激な構造変化の原因はこれまで不明であった。高等生物のゲノムにはレトロトランスポゾンなどに由来する繰り返し配列が大量に存在する。選択圧下でDRCRがこれらの繰り返し配列を含むゲノムで起こると、不要な配列は欠失によって急速に取り除かれ、目的遺伝子が残るため、ユニットの短縮化と多コピー化が予想される。このように急激なゲノムの再編が、今回の研究により説明できると考えられる。多くのがん細胞においてはがん遺伝子の遺伝子増幅がみられ、がんの悪性化の原因と考えられる。増幅領域は不安定で構造変化を起こしやすく、構造変化が進むにつれがんの悪性度が増すが、その原因は不明な点が多い。今回得られたDRCRに伴い組換えが活性化するという知見により、がんで見られるゲノム不安定性のうち、反転および欠失が高頻度で生じる原因について説明できるかもしれない。また、自然界には葉緑体DNAや単純ヘルペスウイルス-1(HSV-1)など高頻度で組換えを起こし、2つ以上のアイソフォームを等量持つゲノムが存在するが、これらの高頻度の組換えの原因は今も分かっていない。興味深いことにこれらのゲノムはDRCRを誘導可能な構造を有している。これらのゲノムでもDRCRとそれに伴う組換えの活性化が生じていると考えると、アイソフォームの形成をうまく説明できる。2ミクロンプラスミド以外にも同様の機構を有するゲノムが自然界に広く存在している可能性を示す例であり、今後興味深い問題である。最後に、いかにしてDRCRに伴い組換えが活性化されるかについてのモデルを提案する。<br/>

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各種コード

  • NII論文ID(NAID)
    500000547401
  • NII著者ID(NRID)
    • 8000000549492
  • 本文言語コード
    • jpn
  • NDL書誌ID
    • 023254327
  • データ提供元
    • 機関リポジトリ
    • NDL-OPAC
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