神経細胞ネットワーク機能解析応用を目的とした培養型プレーナーパッチクランプイオンチャネルバイオセンサの開発

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著者

    • 宇野, 秀隆 ウノ, ヒデタカ

書誌事項

タイトル

神経細胞ネットワーク機能解析応用を目的とした培養型プレーナーパッチクランプイオンチャネルバイオセンサの開発

著者名

宇野, 秀隆

著者別名

ウノ, ヒデタカ

学位授与大学

総合研究大学院大学

取得学位

博士(理学)

学位授与番号

甲第1540号

学位授与年月日

2012-09-28

注記・抄録

博士論文

[序] 膜タンパク質は多くの疾患に関与し、全創薬ターゲットの50%以上を占めるが、それ自身が分子の表面に疎水性領域を持ち、脂質二重膜と呼ばれる内部が疎水性の細胞膜の中に埋め込まれて初めてその生体機能を発揮できる。しかし、脂質二重膜は空気に触れると簡単に分解してしまうため、固体基板への集積が容易でない。そのため、医療応用や創薬に必要な実用的なバイオセンサやバイオチップが存在しないという問題を抱えている。特にイオンチャネルやGタンパク共役受容体は神経での信号伝達や細胞内信号伝達のキーコンポーネントとして生体機能維持に直接かかわっており、多くの重篤な神経系疾患や循環器系疾患などに関与するため、実用的なイオンチャネルバイオセンサの開発に対する国家的社会的重要性と緊急性は明白である。本研究では平面型パッチクランプ技術を基盤とした培養型平面イオンチャネルバイオセンサを開発し、その有用性を実証した。ピペットを用いたパッチクランプ測定装置は唯一の実用的なイオンチャネルバイオセンサとして電気生理学分野にて使用されているが、ピペットの位置合わせに熟練を要するうえ、測定系が大掛かりで、安定性も悪く、スクリーニングに必要な多点測定が不可能である。それに対し多点測定が可能で安定性も良いことが期待される、固体平面基板に微細貫通孔を形成し、そこにイオンチャネル発現細胞やイオンチャネルを脂質二重膜とともに集積した平面型の素子が開発された。しかし、一般に用いられている平面型の素子は培養機能がないため、細胞の長期観測や培養が必須の神経細胞に適用できないという問題がある。本研究では培養機能を平面型パッチクランプ技術に加え従来の平面パッチクランプ法では不可能であった神経細胞の信号伝達機能の機構解明に応用可能なデバイスを開発した。バイオセンサ素子に用いた平面基板材料としてSiO2層が挟み込まれたSOI(silicon on insulator)を用いた。基板の微細貫通孔は半導体プロセスにて用いられるTMAH(Tetramethylammonium hydroxide solution)による異方性ウェットエッチングと集束イオンビーム(FIB; focused ion beam)加工を用いた精密三次元加工法により作製した。培養型平面イオンチャネルバイオセンサはバイオセンサ素子の微細貫通孔によって結合した上下二つのチャンバーから構成されている。その微細貫通孔上に目的のイオンチャネルを発現した細胞をセンサ細胞として配置することによって培養型平面イオンチャネルバイオセンサは動作する。また、シール抵抗が低い場合、電解質溶液等の交換により電極周辺のイオン濃度が変化をきたし大きな電位変動を引き起こす。ピペットパッチクランプ法によるシール抵抗(1 GΩ以上)と比較して我々の培養型平面イオンチャネルバイオセンサはシール抵抗(5-30 MΩ)が低い。これは電気雑音の観点において非常に大きな障害となる。しかし、我々は、シール抵抗と雑音との関係を明らかにし、塩橋型電極を使用して電極電位変動を抑制することにより、十分にこの短所を克服することに成功した。塩橋型電極により、シール抵抗の低さは、培養型平面イオンチャネルバイオセンサの電気生理現象適用の致命的な欠陥ではなくなった。培養型平面イオンチャネルバイオセンサの核となる細胞のセンサ素子上での培養技術の開発を行った。培養型平面イオンチャネルバイオセンサを使用したイオンチャネル電流記録を行う場合、目的となるイオンチャネルを遺伝子発現した細胞をバイオセンサ素子の微細貫通孔上に配置する必要がある。バイオセンサ素子上にて培養を行うため、微細貫通孔の形成された基板上に細胞膜の足場となる細胞外基質(ECM; Extracellular matrix)のコーティングを行った。ECMは細胞外の空間を充填する物質であると同時に骨格的役割、細胞接着における足場の役割、細胞増殖因子、細胞極性、神経突起伸張等の細胞に係わる多彩な役割を担っているタンパク質である。このECMが細胞の生存にとって必須の物質であることを利用して細胞を素子の任意の位置に配置する手法としてECMのパターン形成をプラズマ除去法及びマイクロコンタクトプリンティング法にて行った。プラズマ除去法では大気圧プラズマの照射により照射部分のECMが破壊される特性を利用した。この検証をラット副腎髄質褐色細胞腫由来PC12細胞を用いて行ったところ、大気圧プラズマの照射部位には細胞は培養されず、非照射部位には細胞の存在が確認できた。またマイクロコンタクトプリンティング法では細胞体と神経突起部を空間的に分離した神経ネットワークアレイを形成させるために、細胞体配置部と、神経突起を伸張させるライン部が連続した形状のグリッドパターンを持つポリジメチルシロキサン(PDMS; Polydimethylsiloxane)製スタンプをフォトリソグラフィを用いて作製し、PDMSスタンプを用いてバイオセンサ素子上にECMのパターンを形成し、胎生17日目マウスの大脳皮質由来の神経細胞を用いてバイオセンサ素子上に細胞の形態、成長領域が制御された神経細胞のネットワークアレイを形成させることに成功した。神経回路ネットワーク解析素子への機能応用が可能な培養型平面イオンチャネルバイオセンサの動作試験及び得られたイオンチャネル電流の解析を行った。目的となるイオンチャネルタンパク質としてリガンド作動性のTransient receptor potential type-1 (TRPV1)および、光刺激作動性のChannelrhodopsin-2(ChR2)および、Channelrhodopsin- Wide receiver (ChR-WR)を採用した。測定目的となるイオンチャネルタンパク質を遺伝子発現した培養細胞をバイオセンサ素子の微細貫通孔上に配置しそれぞれの活性刺激に応じたイオンチャネル電流記録を行った。培養型平面イオンチャネルバイオセンサでは素子内にて細胞培養を行うことが可能であるので、他の平面パッチクランプ法では不可能な培養状態の生きた細胞の膜中でのイオンチャネルタンパク質の生の挙動が記録可能である。また、この培養型平面イオンチャネルバイオセンサの精度チェックとしてTRPV1発現HEK293細胞を用いたカプサイシン濃度による検出限界の測定を行った結果、検出限界は約0.01 μMであった。培養型平面イオンチャネルバイオセンサはHEK293,C2C12,PC12といった複数の種類の細胞種での動作を確認しており、これによって得られたイオンチャネル電流の記録結果はピペットパッチクランプ法にて記録された結果と比較し電流波形や応答において遜色のない事を証明した。これより、バイオセンサ素子上での細胞培養の技術を上げることで神経回路ネットワーク解析素子として十分機能するバイオセンサであるといえる。将来的に本素子は難病と言われる神経変性疾患の神経細胞死の基礎過程との関係や発症機構の解明及び治療法の新規開発に応用できると期待される。Membrane proteins account for more than 50% of all drug development targets because they participate in many diseases. A typical membrane protein has a hydrophobic domain on its surface that is buried within a hydrophobic region of the cell membrane, where it contributes to many functions in the living body. However, this interaction readily disintegrates when the lipid membrane is exposed to the air. For this reason, the attachment of a membrane protein onto the surface of a solid substrate is therefore very difficult. Consequently, very few practical biosensors or biochips have been successfully developed for medical and drug applications using membrane proteins. Ion channels play a crucial role in support of many living body functions, particularly in the nervous system, where they serve as key components of signal transmission. These specialized membrane proteins also participate in many serious neurological and cardiovascular system diseases. For example, diabetes is caused by an abnormality of the signaling mechanism that maintains the sugar concentration in blood; dementia is caused by an abnormality of the signaling mechanism that forms the network of nerve cells in the brain. Therefore, membrane proteins also play central roles in these important signaling mechanisms in the cell membrane. The mechanism of these diseases has not yet been clarified, even though many researchers have claimed that abnormalities of these signaling mechanisms are key factors in these diseases.The social importance and urgency for the development of a practical ion channel biosensor are clear. In the present study, I developed an ion channel biosensor device based on a planar patch clamp technology and confirmed its effectiveness experimentally. The pipette patch clamp technique has been used in many electrophysiological investigations, including studies of cell biological function, neural cell signal transduction, and the effects of chemical compounds on ion channel functions. The theory and technique of this extremely powerful method are well established; however, its application to high throughput screening is hampered by the large size of the apparatus. The pipette patch clamp is also easily disturbed by mechanical vibrations, and measurements require a high level of skill. The planar patch clamp has been developed for high through¬put screening, and it has certain advantages over the pipette patch clamp. It is relatively easy to operate and is insensitive to mechanical vibrations; thus, it is suitable for long-term measurements. High-throughput screening devices based on the planar patch clamp are already commercially available; however, these commercialized devices cannot be used in systems that require long incubation times. I have developed an incubation type planar patch clamp device that overcomes this limitation. The addition of an incubation function to the conventional planar patch clamp makes the device applicable to the study of neural cell systems, which often require an incubation function. The biosensor chip is the most important part of this planar patch clamp biosensor. The biosensor fabricated in this study used a Si on insulator (SOI) substrate as the material for the sensor chip. Micropores were formed in the substrate by a semiconductor process using anisotropy wet etching with tetramethylammonium hydroxide (TMAH) and micropores were formed by a focused ion beam (FIB). The chip surface was then made hydrophilic by oxygen plasma, and extracellular matrix (ECM) was deposited onto the chip surface. In some cases, ECM was deposited homogeneously on the chip surface by covering the chip surface by a droplet of the ECM solution, but, in other cases, it was deposited only around the micropores using micro contact printing (μCP) and an atmospheric-pressure plasma (APP) method. In the latter method, the sensor cell attached to the patterned area spontaneously, since the ECM contains essential materials for cell viability. The device structure was completed by setting a sensor cell, which expressed the ion channel protein of interest, onto the micropore.One limitation of the incubation type planar patch clamp is that high seal resistance is difficult to realize; the value was typically about 5-30 MΩ. This low seal resistance causes large base line fluctuations. Since the fluctuations in the solid-liquid and liquid-liquid interface potentials around the electrode are the main source of the baseline fluctuations, I stabilized the electrode with a salt bridge structure, which reduced the base line fluctuation to less than 10 pA. I investigated the performance of this incubation type planar patch clamp biosensor with its stabilized electrode by examining photo-stimulated type (channelrhodopsin-2 (ChR2) expressing C2C12 cells and channelrhodopsin-wide-receiver (ChRWR) expressing HEK293 cells) and ligand-gated type (TRPV1-expressing HEK293 cells ) sensor cells. The channel currents were induced by laser stimulation and capsaicin stimulation, respectively. In both cases, stable and sufficiently low noise current recordings, with levels equivalent to previously reported data measured by pipette patch clamp, were obtained in the whole-cell mode.In my group, we will use incubation type planar patch clamp devices for the investigation of nuclear reactions in neural cells. I believe that this ion channel biosensor device developed in my research will be a useful new experimental tool for advancing knowledge in this new science field.

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各種コード

  • NII論文ID(NAID)
    500000574194
  • NII著者ID(NRID)
    • 8000000576519
  • 本文言語コード
    • jpn
  • NDL書誌ID
    • 024793817
  • データ提供元
    • 機関リポジトリ
    • NDL ONLINE
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