Capillaria hepatica実験感染マウスにおけるⅡ型クリオグロブリン血症の病理発生機序の解明 The study on the mechanism of development of mixed cryoglobulinemia in Capillaria hepatica-infected mice

第1章　緒言　クリオグロブリン（CG）血症は、低温下で沈殿する血清中の免疫グロブリンの産生を特徴とし、多くは特定の感染症に関連して発症する。ヒトにおけるCG血症は、C型肝炎ウイルス（HCV）感染に随伴したⅡ型CG血症が最も多い。しかし、病原体感染に関連したCG血症の実験動物モデルは確立されておらず、研究対象が発症後の患者検体の限られていることから、感染に起因するCG血症の病理発生機序は、未だ解明されていない。　著者らは、げっ歯類を宿主とする線虫であるCapillaria hepatica（C. hepatica）の感染により、マウスがCG血症を高率に発症することを見出した。本研究は、C. hepatica実験感染CG血症マウスモデルを確立し、本モデルにおけるCG血症発症のメカニズムを明らかにすることを目的とする。第2章　C. hepatica実験感染CG血症マウスモデルの確立　C. hepaticaの幼虫形成卵をICRマウスに経口接種すると、全個体（15/15匹）において肝臓実質に虫体の感染が確認された。接種後20日の脾臓では、IgMκ陽性Bリンパ球が増加し、接種後20日からは血清中にIgAおよびIgMκからなるCGが全例で認められた。さらに、接種後30日の血清では、IgM型RFが有意に上昇していた。接種後30日の腎臓では糸球体がび漫性に腫大し、毛細血管腔を塞栓するIgMを含む硝子様物が観察された。以上の所見から、本病態がモノクローナルなIgM型RFとポリクローナルなIgAから構成されるⅡ型CG血症であることが示された。従来、実験動物において感染した宿主に高率にCG血症を発症させる病原体はなく、本モデルは、感染に起因して発症するⅡ型CG血症の初のモデルである。HCV感染患者や既報の動物モデルにおいて解明することができなかった重要な課題は、病態の初期段階で起こるCG産生細胞の選択的増殖のメカニズムであり、本モデルは、感染からCG血症が発症するまでの過程を解析できることに最大の利点があると考えた。そこで、第3章では本モデルを使い、CG血症発症初期段階におけるBリンパ球の選択的増殖過程を評価することとした。第3章　クリオグロブリン血症発症初期段階におけるBリンパ球の選択的増殖のメカニズムの解明　本章では、C. hepatica感染からCG血症の発症までの病態において、1．CGを形成するIgMが認識する虫体特異抗原、2．IgM RF産生細胞の性状、3．病態進行の促進因子の解析を目的とし、以下の実験を行った。3-1．CGを形成するIgMが認識する抗原の解析　CGを構成するIgMが認識するC. hepatica抗原を明らかにするため、C. hepatica虫体可溶性画分（ChSF）を試料とし、感染マウス血清、CG可溶化物を一次抗体として用いてウエスタンブロッティングを行った。また、血清及びCGの虫体への反応性を蛍光免疫染色により検出した。接種後24日のCG中IgMは、約75kDaの虫体抗原に特異的に反応した。また、免疫染色でCG中のIgMは、虫体の消化管に特異的に結合した。以上の結果から、本モデルのCGは、虫体特異抗原に対して特異的に結合するIgMで構成されることが示唆された。3-2．IgM RF産生細胞の性状解析　次に、IgM RFを産生する細胞の同定および性状解析を行った。CG血症発症マウスの脾臓赤脾髄領域では、IgMκ陽性細胞が優位に増加しており、フローサイトメトリー及び共焦点顕微鏡による解析から、増加するB細胞は、μ鎖+κ鎖+CD45R/B220+CD5+のB-1a細胞であることが明らかとなった。CGがIgMκから構成されることから、脾臓で増加するこのIgM+κ+ B-1a細胞がIgM RF産生細胞であると仮定した。そこで、ChSFが感染マウス脾臓B-1a細胞に与える影響をin vitroにおいて評価した。　接種後24日の感染マウスから単離した脾臓B-1a細胞をChSFで刺激すると、細胞増殖およびIgM産生が亢進した。産生されたIgMはCGと同様に約75kDaの虫体抗原に特異的に結合した。また、IgM可変領域のRT-PCRでは、ChSF刺激により、約1,100bpの可変領域mRNA発現が上昇した。発症マウス個体間で共通して、約1,100bpの可変領域mRNA発現を認めた。　以上の結果から、ChSFによる刺激で、B-1a細胞の選択的な増殖が促進されており、このIgM+κ+ B-1a細胞がCG産生細胞であると考えられた。3-3．病態進行の促進因子の解析　CG血症の進行には、宿主Th1/Th2応答性の違いが関与しているという仮説を立て、異なるマウス系統を用いて感染実験を行った。その結果、感染時のTh1/Th2応答性は、BALB/cとC57BL/6では異なっており、Th2に偏向した免疫応答がBALB/cでは起こり、C57BL/6では起こらなかった。また、感染したBALB/cマウスでは、全身性の好酸球増多症が起こっていた。このことから、CG産生細胞であるB-1a細胞と好酸球の両方に対する増殖・活性化因子であるIL5に着目した。血清中IL5濃度は、BALB/cマウスで感染後20日に一過性に高度に上昇したが、C57BL/6では顕著な上昇は見られなかった。また、C57BL/6を遺伝的背景に持ちIL5を過剰発現する、IL5tgC57BL/6マウスを用い感染実験を行ったところ、IL5の血中濃度は感染前から高値であり、感染後はさらに著しく上昇していた。次に、これら3系統のCG血症の病態を比較した。BALB/cマウスでは、接種後24日に、CGの形成、血清中IgM RF濃度の上昇、糸球体へのIgMの沈着を認めたが、C57BL/6マウスではいずれも軽度であった。一方、IL5tgC57BL/6マウスでは、BALB/cマウスに匹敵するCG血症が惹起された。このことから、Th2に偏向した免疫状態下でCG血症の病態は促進され、それにはIL5が関与していることが示唆された。　感染により高度なCG血症を発症したBALB/cマウスおよびIL5tgC57BL/6マウスにChSFを腹腔内投与したところ、IL5tgC57BL/6マウスでのみCG血症が惹起された。ChSF投与では、炎症反応は誘起されず、IL5濃度に変化はなかった。このことから、感染によるTh2免疫応答は、IL5を上昇させるために重要であり、CG血症の進行に必須の因子はIL5であることが示された。　以上の結果から、本モデルにおけるCG血症発症には、1. 脾臓B-1a細胞（IgM RF産生細胞として）、2. 特異抗原（IgM RF産生B-1a細胞の増殖、IgM産生のトリガーとして）、3. IL5（CG血症の促進因子として）の3つの因子が必須であることが明らかになった。第4章　IgM RF産生B-1a細胞における増殖抑制因子Stra13発現解析　接種後24日はCG血症の病態がピークの時期であるが、接種後24日で脾臓から単離したB1a細胞をChSF、IL5およびLPSで刺激すると、ChSF刺激でのみ細胞増殖およびIgM産生が亢進し、IL5およびLPS刺激には反応しなかった。この結果から、CG血症の病態がピークに達する時期には、CG産生細胞はすでに機能的に抑制状態にあると推察された。そこで、関与が示唆されるB細胞抑制因子Stra13発現をRT-PCRにより調べた。その結果、非感染マウスのB-1a細胞にはStra13は発現していなかったが、接種後24日のB-1a細胞には強い発現が認められた。脾臓単離リンパ球からはStra13の発現は検出されず、Stra13発現がB-1a細胞に限定していることが示唆された。ChSF刺激によりB-1a細胞におけるStra13発現が低下し、細胞増殖、IgM産生が亢進することから、この抑制機序が可逆的であることが示唆され、ChSF中の特異抗原がStra13発現制御に関与していることが考えられた。また、B-1a細胞はLPS刺激によりStra13発現が低下したものの、細胞増殖やIgM産生が起こらないことから、Stra13以外の抑制機序が存在することが示唆された。第5章　総括　C. hepaticaの実験感染により、高い再現性を持つII型CG血症マウスモデルを確立した。CG血症発症の初期段階には、IgM RF産生B-1a細胞の選択的増殖の過程があり、発症には、1. IgM RF産生細胞として脾臓B-1a細胞、2. IgM RF産生B-1a細胞の増殖、IgM産生のトリガーとしての特異抗原、3. CG血症の促進因子として IL5の、3つの因子が必須であることが示された。急速に増殖したIgM RF産生細胞には、速やかにB細胞増殖抑制因子Stra13が発現することが示され、増殖に適した条件から逸脱した場合には、それらの細胞は速やかに不活性化状態になることが示唆された。本モデルは、CG血症において病態解析が困難であった発症初期の解析が可能である有用な動物モデルであり、本モデルで得られた知見は、病原体感染に起因するCG血症の病態解明につながることが期待される。

Chapter 1: IntroductionChronic infection by pathogens such as the hepatitis C virus (HCV) induces monoclonal or oligoclonal proliferation of B-cells, which produce IgM rheumatoid factor (RF) leading to the development of mixed cryoglobulinemia (MC). Pathogenesis of MC has not yet been completely clarified because of the lack of an experimental animal model. In the present study, the author established an animal model of MC that is induced by experimental infection with Capillaria hepatica (C. hepatica) in mice and examined the mechanism of the development of MC in C. hepatica-infected mice.Chapter 2: MC mouse model induced by C. hepatica-infectionIn this chapter, the author established a MC mouse model induced by C. hepatica-infection. ICR mice experimentally infected with C. hepatica eggs developed cryoglobulinemia at 20 and 30 days post injection (DPI). Using immunological analysis, cryoglobulinemia of the infected mice was classified as type II MC by detection of monoclonal IgM rheumatoid factor and IgA in the cryoprecipitate of serum. Using immunofluorescence, we observed an increase in the number of double-positive cells for μ heavy and κ light chains of immunoglobulin in the spleens of infected mice. Histopathologically, this model was characterized by glomerulopathy associated with intense deposition of IgM and IgA filling in capillary lumina. Ultrastructural analysis showed that glomerular deposits consisted of stacks of twisted microtubular structures. These serological and histological features resembled those of type II mixed cryoglobulinemia in human. This is the first experimental animal model of type II mixed cryoglobulinemia that will enable detailed studies on the pathogenesis of cryoglobulinemia. To date, the mechanism of selective lymphoproliferation during the early stage of MC has not been defined because of the difficulty associated with the collection of samples from early stage MC patients. The C. hepatica-induced MC model allows the analysis of selective lymphoproliferation during the early stage of MC. Therefore, the author examined the mechanism of selective lymphoproliferation in the following chapter.Chapter 3: Selective proliferation of splenic B cells during the early stage of MC To clarify the mechanism of selective lymphoproliferation, the following points are important: identification of the antigen triggering the process, the phenotype of IgM-RF-secreting cells, and the immune status supporting MC progression.3.1. Characterization of serum cryoglobulin in C. hepatica-infected mice To examine the reactivity of cryoglobulin to C. hepatica antigens, the author performed immunofluorescence analysis using serum samples or the cryoglobulin solution samples from BALB/c mice as primary antibody against the section of rat liver collected at 24 DPI, and western blot analysis using C. hepatica soluble fraction (ChSF) as loading sample. As a result, the specific binding of IgM in cryoglobulin to the digestive tract of the C. hepatica adult worm and to a 75 kDa antigen in the ChSF was confirmed in all infected mice. Therefore, the cryoglobulin might be composed of the monoclonal or oligoclonal IgM raised against the specific worm antigen in the ChSF.3.2. Characterization of the IgM-RF-secreting cells At 24 DPI, C. hepatica-infected BALB/c mice showed significant splenomegaly, and a large number of IgM+κ+ B cells were observed in the splenic red pulp. To characterize the IgM+κ+ B cells, we divided the IgM+κ+ B cells into three groups (B-2, B-1a, and B-1b) according to the expression of CD5 and CD45R/B220 using flow cytometric analysis. CD5-positive B-1a cells were rare in the spleen of uninfected mice and significantly increased in the spleen of C. hepatica-infected mice. The author postulated that the B-1a cells that proliferated in the spleen might produce cryoglobulin; therefore, the response of splenic B-1a cells from infected mice against ChSF was analyzed by assessing cell proliferation and IgM production. In vitro assays using B-1a cells from infected mice showed that stimulation by ChSF promoted the proliferation of B-1a cells and secretion of IgM. The produced IgM bound to the 75 kDa antigen similar to cryoglobulin, and B-1a cells expressing a restricted repertoire of μ chain variable regions selectively proliferated. These results suggested that the antigen-specific splenic B-1a clone was of cryoglobulin-secreting cells.3.3. Study on the immune status supporting MC progression To verify the hypothesis that the Th1/Th2 immune response plays a role in the development of cryoglobulinemia, the author used two mouse strains with different Th responses. As a result, C. hepatica-infection induced Th2 polarization accompanied by systemic eosinophilia in BALB/c mice, but not in C57BL/6 mice. Eosinophil proliferation and activation are mediated by IL-5, which is a Th2 type cytokine. IL-5 is also known as a critical growth factor for B-1 cells. Therefore, the author postulated that IL-5 might be the essential promoting factor of cryoglobulinemia, and evaluated the serum IL-5 level in BALB/c, C57BL/6, and IL-5 transgenic mice with the C57BL/c background (IL-5tg-C57) showing IL-5 over expression. Serum IL-5 levels at 20 DPI were significantly higher in BALB/c mice than in uninfected BALB/c mice and infected C57BL/6 mice. The serum IL-5 level in uninfected IL-5tgC57BL/6 mice was 40.5 pg/ml and significantly increased in response to infection at 20 and 24 DPI. Next, the author examined the development of cryoglobulinemia in 3 strains. At 24 DPI, cryoprecipitate was observed in BALB/c and IL-5tgC57BL/6 mice. The severity of MC was correlated with the increase in serum IL-5 levels in the infected mice. These findings showed that cryoglobulinemia was exacerbated in the Th2 biased immune condition, and that IL-5 was a critical promoting factor of cryoglobulinemia. Furthermore, intraperitoneal injection of ChSF caused MC without an inflammatory response in IL-5tgC57BL/6 mice, indicating that cryoglobulinemia could be induced by co-stimulation ChSF and IL-5 without infection in vivo.In this chapter, the author identified the following three factors essential for the pathogenesis of cryoglobulinemia following selective lymphoproliferation: 1) splenic B-1a cells as IgM-RF-secreting cells, 2) C. hepatica-specific antigens as a trigger of B-1a cell proliferation and IgM production, and 3) IL-5 as an essential promoting factor of the selective lymphoproliferative stage of MC.Chapter 4: Rapid acquisition of an exhausted phenotype during the remission stage of MC The progression of MC was associated with necrotic hepatitis caused by C. hepatica worms; rapid progression of MC is associated with exacerbation of hepatitis during 20 to 30 DPI, and remission of MC is associated with cure of hepatitis and death of worms in the liver during 30 to 110 DPI. The author postulated that there might be a mechanism of rapid acquisition of exhausted phenotype during the remission stage of MC. To verify the hypothesis, the author examined the expression of Stra13 transcripts, a powerful negative regulator of B cell activation, in B-1a cells from uninfected and infected BALB/c mice at 24 DPI. As a result, the B-1a cells from infected mice at 24 DPI expressed abundant transcript of Stra13. On the other hand, B-1a cells from uninfected mice did not express Stra13 transcript. In addition, Stra13 mRNA expression on B-1a cells from infected mice at 24 DPI was down-regulated by ChSF stimulation, and the stimulation by ChSF promoted the proliferation of B-1a cells and secretion of IgM. The Stra13 expression in the B-1a cells from infected mice at 24 DPI suggests that these cells may have already acquired a functionally exhausted phenotype though IgM-RF in the serum and IgM deposition in the glomeruli peaked at 24 to 30 DPI, and that the functional defect may be overcome by ChSF stimulation.Chapter 5: Conclusions MC mouse model induced by C. hepatica-infection is the novel experimental animal model of MC induced by infection. In the present study, the author identified the following three factors essential for the pathogenesis of cryoglobulinemia following selective lymphoproliferation: 1) splenic B-1a cells as IgM-RF-secreting cells, 2) C. hepatica-specific antigens as a trigger of B-1a cell proliferation and IgM production, and 3) IL-5 as an essential promoting factor of the selective lymphoproliferative stage of MC. In addition, the proliferated splenic B-1a cells rapidly acquired exhausted phenotype by overexpressed Stra13 transcript, a powerful negative regulator of B cell activation, during the remission stage of MC. This mouse model allows the analysis of selective lymphoproliferation during the early stage of MC, and will provide new insights for the pathogenesis of MC induced by infection.